(1)饲喂14CO2与定时取样
向正在进行光合作用的藻
液 中 注 入 14CO2 使 藻 类 与 14CO2接触，每隔一定时间 取样，并立即杀死。
H14CO3-+H
＋
→14CO2+H2O
图 用来研究光合藻类CO2固 定仪器的图解
(2)浓缩样品与层析
用甲醇将标记化合物提 取出来，isco作用下RuBP的C-2位置上发生羧化反应形成2-羧基-3-酮 基阿拉伯糖醇-1,5-二磷酸，它是一种与酶结合不稳定的中间产物，被水 解后产生2分子PGA。
Rubisco（L8S8）结构
的方法以区分二 聚体的边界。 Rubisco 被 认 为 普 遍 存在的蛋白质构成了 叶绿体基质蛋白质的 一半。
(1)14C同位素标记与测定技术 可排除原先存在于细胞里 的物质干扰，凡被14C标记的物质都是处理后产生的 (2)双向纸层析技术 能把光合产物分开
选用小球藻等单细胞的藻类作材料，藻类不仅在生化性质 上与高等植物类似，且易于在均一条件下培养，还可在试验所 要求的时间内快速地杀死。
试验分以下几步进行：
光合试验中RuBP与PGA相互转化
经过10多年周密的研究，卡尔文等人终于探明了光合作用中
从CO２到蔗糖的一系列反应步骤，推导出一个光合碳同化的循环 途径，这条途径被称为卡尔文循环或Calvin-Benson循环 。
由于这条途径中CO2固定后形成的最初产物PGA为三碳化合 物，所以也叫做C３途径或C３光合碳还原循环，并把只具有C３途 径的植物称为C３植物。
用纸层析和放射自显影技术追踪被 14CO2标记的产物
起先猜测CO2是与某一个2 碳的片断结合生成3碳的PGA， 然而情况并非如此。
当光下把CO2浓度突然降低， 作为CO2受体的化合物会积累 起来。这一化合物被发现是含
有5个C的核酮糖-1,5-二磷酸
(RuBP)，当它接受CO2后，分 解为2个PGA分子。
植物的光合作用二
一.C3途径
糖和淀粉等碳水化合物是光合作用的产物，这在100多年 前就知道了，但其中的反应步骤和中间产物用一般的化学方 法是难以测定的。因为植物体内原本就有很多种含碳化合物， 无法辨认哪些是光合作用当时制造的，哪些是原来就有的。 况且光合中间产物量很少，转化极快，难以捕捉。
1946 年 ， 美 国 加 州 大 学 放 射 化 学 实 验 室 的 卡 尔 文 (M.Calvin)和本森(A.Benson)等人采用了两项新技术：
➢ 全过程分为羧化、还原、 再生3个阶段。
一分子C02固定需要消耗2分子 NADPH和3分子ATP
光合碳还原循环
再生
羧化 还原
(1) 羧化阶段
指进入叶绿体的CO2与受体RuBP结合，并水解产生PGA的反应过程。 以固定3分子CO2为例： 3RuBP+3CO2+3H2O Rubisco 6PGA + 6H+ 核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)具有双重功能，既能使 RuBP与CO2起羧化反应，推动C3碳循环，又能使RuBP与O2起加氧反应 而引起C2氧化循环即光呼吸。 羧化阶段分两步进行，即羧化和水解：
此项研究的主持人卡尔文获得了1961年诺贝尔化学奖。
光合碳还原循环
➢代谢产物名：RuBP.
1,5 二磷酸；
PGA.3-磷酸甘油酸； BPGA.1，3 二磷酸甘
油酸； GAP.甘油醛-3-磷酸； DHAP.二羟丙酮
磷酸； FBP.果糖-1，6-二磷酸； F6P.果糖-6-
磷酸； E4P.赤藓糖-4-磷酸； SBP.景天庚酮糖
Rubisco包含16个蛋白亚基： 8个小亚基（SSU）和8个大 亚基（LSU）。SSU的基因 rbcS存在于核中，而LSU的 rbcL基因是由质编码的。这 个酶的合成量可能是地球上 合成的蛋白质中最多的，需 要两个基因组的表达并需要 三个亚细胞参与：细胞核， 细胞溶质和叶绿体。
(3)鉴定分离物
采用放射自显影技术， 鉴定被14CO2标记的产物并 测定其相对数量。
(4)设计循环图
根 据 被 14C 标 记 的 化 合 物出现时间的先后，推测 生化过程。根据图D所显 示 的 结 果 ， 即 短 时 间 内 (5 秒，最终到0.5秒钟)14C标 记 物 首 先 出 现 在 3- 磷 酸 甘 油 酸 (PGA) 上 ， 说 明 PGA 是光合作用的最初产物。
5-二磷酸核酮糖羧化酶分子晶体点阵的排列
晶体点阵：一种由晶体的原子、分子或离子 在空间各点所作的几何排列
植物Rubisco的合成、加工和组装
Rubisco大亚基由叶绿体DNA 编码，并在叶绿体的核糖体上翻译， 而小亚基则由核DNA编码，在细 胞质核糖体上合成。
Rubisco全酶由细胞质中合成 的小亚基前体和叶绿体中合成的大 亚基前体经修饰后组装而成。
1，7-二磷酸(酯)酶(SBPase)； (11)核酮糖-5磷酸表异构酶； (13)核糖-5-磷酸异构酶； (14) 核酮糖-5-磷酸激酶(Ru5PK)
(一) C３途径的 反应过程
➢ C３途径是光合碳代谢中最 基本的循环，是所有放氧 光合生物所共有的同化 CO2的途径。
1.过程
➢整个循环如图所示，由 RuBP开始至RuBP再生结 束，共有14步反应，均在 叶绿体的基质中进行。
-1,7-二磷酸； S7P.景天庚酮糖-7-磷酸； R5P.
核糖-5-磷酸； Xu5P.木酮糖-5-磷酸； Ru5P.
核酮糖-5-磷酸； G6P.葡萄糖-6-磷酸； TPP.
硫胺焦磷酸； TPP-C2.TPP羟基乙醛
参与反应的酶：(1)核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶 (Rubisco) ； (2)3- 磷 酸 甘 油 酸 激 酶 (PGAK) ； (3)NADP-甘油醛-3-磷酸脱氢酶； (4)丙糖磷酸异 构酶； (5)(8)醛缩酶； (6)果糖-1,6-二磷酸(酯)酶 (FBPase)； (7)(10)(12)转酮酶； (9)景天庚酮糖
Rubisco的结构与组装
➢在植物叶绿体中，Rubisco由8 个大亚基（56 000）和8个小亚 基（14 000）组成。在结构中四 个可见圆形突出的每一个都包含 一个大亚基和一个小亚基。小亚 基以红色，大亚基以蓝色和绿色 表示（L8S8）。
RUBISCO大亚基的三维结构
➢其催化活性要依靠大、 小亚基的共同存在才能 实现。 ➢Rubisco约占叶绿体 可溶性蛋白的50%，因 此它也是自然界中最丰 富的蛋白质。