微生物学实验报告乳酸菌分离纯化——双歧杆菌的分离纯化2012/6/5实验目的：从酸奶等富含乳酸菌的物质中分离到具有活性的双歧杆菌并进行初步鉴定。

实验原理：双歧杆菌是动物体肠道内的正常优势生理细菌，革兰氏阳性，无芽孢，没有运动能力，最适生长温度37℃~41℃，专性厌氧。

双歧杆菌的细胞呈现多样形态，有短杆较规则形、纤细杆状具有尖细末端形、球形、长杆弯曲形、分枝或分叉形、棍棒状或匙形。

单个或链状、V形、栅栏状排列，或聚集成星状。

双歧杆菌的菌落光滑、凸圆、边缘完整、乳脂至白色、闪光并具有柔软的质地(7)。

因为双歧杆菌是严格厌氧细菌，所以双歧杆菌的培养条件必须无氧，且培养基要具有低氧化还原电势。

培养双歧杆菌最常用的方法是亨盖特厌氧滚管法(1, 5, 7)，此外还有厌氧箱法，厌氧袋法和厌氧罐法等。

亨盖特厌氧滚管法是亨盖特（Hungate）于1950年发展起来的一套严格厌氧微生物的培养技术，主要原理是利用铜柱氧化除氧的滚管分离纯化法。

亨盖特厌氧滚管法的优点是可以实时检查培养物，无氧效果好且花费不高，但需要专门的仪器和技术性很强的操作。

本实验采用的简易厌氧罐法是一种操作简单且成本很低的方法，主要原理是利用焦性没食子酸除去厌氧罐内的氧气。

该方法的缺点是焦性没食子酸与NaOH反应过程中会产生一定量的NO，可能不利于细菌的生长；此外，过量的NaOH 会将厌氧罐中的CO2一起除掉，而CO2对多数厌氧菌的生长有促进作用。

另外，在同一个培养皿上接种好氧细菌（如大肠杆菌和枯草杆菌）能加强除氧的效果。

本实验所用的培养基参考了NPNL培养基(6)和BS培养基的配方，其中鱼粉、牛肉膏、酵母浸粉、胰蛋白胨的作用是提供氮源、维生素和生长因子，葡萄糖和乳糖为乳酸菌发酵提供糖类底物，磷酸氢二钾和磷酸二氢钾为酸碱缓冲剂，硫酸亚铁、硫酸锰为乳酸菌提供生长因子，氯化钠维持均衡的渗透压。

如果在培养基中加入一定浓度的抗生素，比如硫酸卡那霉素（75μg/ml）、硫酸新霉素（30-200μg/ml）、硫酸巴龙霉素（20-200μg/ml）、萘啶酮酸（15或80μg/ml）、氧化锂（3mg/ml）、丙酸钠（10或15g/L）、山梨酸（0.4g/L）等，培养基就成为双歧杆菌的选择性培养基(7)。

实验材料：蒙牛冠益乳（含bb-12双歧杆菌），伊利酸牛奶（ABLS益生菌），佳宝、光明原味酸牛奶，双歧杆菌乳酸菌三联活菌片（含长型双歧杆菌Bifidobacterium longum），枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）实验方法：1.培养基双歧杆菌琼脂培养基【蛋白胨（鱼粉）10.0g，牛肝浸粉5.0g，牛肉膏3.0g，酵母浸粉5.0g，胰蛋白胨8.0g，可溶性淀粉0.5g，磷酸氢二钾1.0g，磷酸二氢钾 1.0g，葡萄糖10.0g，乳糖3.0g，L-半胱氨酸0.5g，琼脂15g，吐温80 1g，溶液A （FeSO4·7H2O 0.2g，MgSO4·7H2O 4.0g，MnSO4·4H2O 0.135g，NaCl 0.2g 于100ml蒸馏水定容）10ml，蒸馏水定容至1L】枯草芽孢杆菌LB琼脂培养基【胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，Nacl10g/L，琼脂粉15g/L】2.简易厌氧罐法将双歧杆菌琼脂培养基倒入培养皿中，待培养基冷却后，先用接种环取LB琼脂培养基上生长的枯草芽孢杆菌菌落接种在培养皿一侧，再于另一侧划线接种酸奶或三联活菌片的稀释液，按照每L容积1.0g 焦性没食子酸、10%NaOH溶液10ml加入厌氧罐后，立即以凡士林和胶带密封，置于37℃恒温培养2-3天。

图1. 实验中使用的简易厌氧罐实验结果：以双歧杆菌乳酸菌三联活菌片为菌源，在厌氧罐中经过72h 恒温培养得到了以双歧杆菌为主的单菌落。

因为双歧杆菌暴露在空气中短时间内即大量死亡，划线分离方法会使双歧杆菌活性大大降低，加之时间所限（由于需要摸索实验条件，寻找合适菌源，首次成功得到双歧杆菌单菌落已是第三周），最终没有获得双歧杆菌的纯培养和相关生化指标。

但仅从形态学特征(3)可以判断，该实验方法已经分离得到双歧杆菌（Bifidoubacterium sp.）。

所以本实验仅就双歧杆菌的形态学特征进行观察总结。

图2. 培养72h 后的双歧杆菌分离培养基。

左侧接种枯草杆菌，几乎没有形成明显的菌落；右侧接种三联活菌片稀释液，有大小不等乳白色半透明光滑圆形菌落，偏小的菌落多为双歧杆菌菌落。

图3. 双歧杆菌革兰氏染色照片（1000×），显示双歧杆菌具有多种特殊形态。

此外，视野中有细杆形杂菌。

图4. 局部放大后观察到的双歧杆菌形态。

可以看到双歧杆菌具有分支形态和末端膨大形态，分支长度和角度因个体而异，没有明显的一致性，末端膨大处最大直径约1μm。

图（a）中有“f”形个体，实为细胞中部向两侧分支的细胞。

图（b）下方的细胞分支较多，其中有三个为主要分支，较长的两个分支长度约5μm，在较长的分支上还有小分支。

图片上方有末端分支的细胞。

图（c）和图（d）显示了双歧杆菌典型的“Y”形分支。

一般具有这种典型形态的双歧杆菌细胞长度约3-4μm，分支长度在1μm左右。

实验反思：1. 成功培养双歧杆菌的关键条件之一是要保证菌源中含有足够数量的活双歧杆菌。

实验最初使用的菌源是市售各种品牌的酸牛奶，但是在对酸奶稀释液进行镜检时，所有的产品都没有看到疑似有双歧杆菌特征的细胞。

以蒙牛冠益乳为例，虽然奶盒标签上标明内含双歧杆菌BB-12的浓度不少于1×109CFU/ml，但镜检中发现链球菌的数量占绝大比例，此外还有少量长杆菌。

以蒙牛冠益乳为菌源，分别用涂布平板法和倾注平板法在厌氧罐中培养48h后，菌落经镜检鉴定几乎全部为链球菌菌落，没有发现双歧杆菌菌落，证明所用菌源中链球菌是绝对优势菌群。

以其它品牌酸牛奶为菌源也有类似情况，虽然链球菌和杆菌的比例不同，但都没有发现双歧杆菌。

考虑到当今技术条件下双歧杆菌的发酵培养并不十分困难，任何一家有资质的乳品企业都有能力保证出厂酸奶中双歧杆菌的添加量，而且像蒙牛冠益乳这样具有世界影响力（第十五届世界食品科技大会“全球食品工业奖”）的酸奶品牌应该没有质量问题，因此可以推测，市售酸奶中分离不到双歧杆菌的主要原因是酸奶出厂后在运输和销售途径中保存不当（主要是保存温度偏高），使绝大部分双歧杆菌失去活性。

所以，若要从添加双歧杆菌的酸奶中分离双歧杆菌，需要使用全程低温保鲜的新鲜酸奶。

相对于酸奶，药店中出售的双歧杆菌活菌片的生产和保存更加严格，而且药片的胶囊化也利于厌氧菌的保藏。

以本实验使用的双歧杆菌乳酸菌三联活菌片（Live Combined Bifidoubacterium and Lactobacillus Tablets）为例,药片中含有三种常见乳酸菌：长型双歧杆菌（1×107CFU/g），保加利亚乳杆菌（1×106CFU/g），嗜热链球菌（1×106CFU/g）。

经厌氧罐法涂布平板37℃恒温培养72h后，分离得到的菌落主要是保加利亚乳杆菌和双歧杆菌菌落（其中保加利亚乳杆菌菌落较多）。

所以用三联活菌药片作为菌源分离双歧杆菌是实际上可行的。

2. 成功培养双歧杆菌的另一个关键条件是要保证培养过程绝对无氧。

首先是接种时操作要尽量迅速，本实验的接种操作从药片溶解（药片溶解在无菌水中时不能剧烈震荡，以免双歧杆菌与大量氧气接触）到密封除氧不超过5min。

在加入除氧剂并以凡士林密封后，最好以胶带粘封厌氧罐边缘，保证培养过程中皿盖不会因振动滑移而破坏厌氧环境。

除氧剂的用量可以稍过量，以弥补封罐前的损失。

实验证明，焦性没食子酸除氧的效率很高，如果微微打开皿盖边缘，立即将划燃的火柴凑近皿盖边缘，火柴会在瞬间熄灭。

3. 实验在分离双歧杆菌的过程中先后分离到了大量嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的单菌落，虽然这两种细菌不是目的菌，但分别对两种菌的菌落和细胞形态的观察也发现了一些有趣的现象，一并整理在此报告中。

a b c d图5. 厌氧条件下从蒙牛冠益乳中分离得到的嗜热链球菌在琼脂培养基表面生长的形态。

可以看到链球菌单个球形细胞之间首尾相连形成弯曲折叠的长链。

该图片为直接观察培养基表面获得。

图6. 从双歧杆菌乳酸菌三联活菌片中分离到的保加利亚乳杆菌番红染色。

从图中可以看出，保加利亚乳杆菌为典型的长杆菌，个体间直径相差不大，都不足1μm，但长度相差较大，单个菌体最长可达30-40μm。

图7. 对保加利亚乳杆菌的革兰氏染色可以观察到个别菌体内有深染的颗粒状物质。

具有颗粒物的菌体比例和颗粒物的密度因菌落的不同而有明显差异。

猜测颗粒物的形成与菌体的代谢产物有关。

参考文献：1. E. Hungate & J. Macy: The Roll-Tube Method for Cultivation of Strict Anaerobes. Bull. Ecol. Res. Comm. (Stockholm) 17: 123-125 (1973).2. Tanaka & Masahiko Mutai: Improved Medium for Selective Isolation and Enumeration of Bifidobacterium. APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Nov. 1980.3. James A. Poupard, Intisar Husain, Robert F. Norris: Biology of the Bifidobacteria. BACTERIOLOGICAL REVIEWS, June 1973.4. Intisar Husain, James A. Poupard, Robert F. Norris: Influence of Nutrition on the Morphology of a Strain of Bifidobacterium bifidum. JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Sept. 19725. 李平兰, 张篪: 利用亨盖特厌氧滚管技术检测双歧杆菌制品中的活菌数, Food Science, 2, 1992.6. 马钢: 酸奶及其饮料中双歧杆菌分离培养与计数, Food Science, 11, 1994.7. 凌代文: 乳酸细菌分类鉴定及实验方法, 1999.。