1.概述口蹄疫（Foot and mouth disease, FMD）是由口蹄疫病毒（Foot and mouth disease virus, FMDV）引起的牛羊猪等家畜严重的急性传染病，由于其传播快，给畜牧业造成了巨大的经济损失，而且严重影响国际贸易，世界动物卫生组织将其列为必须上报的疫病之一。

FMD 血清型众多，包括O、A、Asia1、SAT1、SAT2和SAT3型共7个血清型，血清型间无交叉保护，造成疫病控制难度较大。

截至到2010年12月，全球FMD流行国家达60个，大多集中在亚非拉等发展中国家，给这些国家的畜牧业发展带来消极的影响，而因FMD贸易壁垒造成的畜产品出口损失远远大于疫病本身所带来的动物死亡的损失。

世界各国都通过种种努力实现OIE认定的“无FMD疫区国”地位，发达国家通过扑杀等措施几乎没有FMD的流行，而南美洲一些国家通过免疫接种等措施实现了无FMD疫区或部分地区无疫区。

欧洲上世纪90年代开始实行不免疫策略,在疫情暴发时采用扑杀的手段控制FMD,但英国2001年FMD的爆发给当地经济社会造成巨大的损失，促使相关机构开始修订FMD防控策略，2003年欧盟修订了FMD防控策略，肯定了疫苗免疫在FMD爆发时的作用，随后欧盟多个国家将疫苗免疫作为补充手段用于FMD的控制。

灭活疫苗在欧美等地的FMD防制和根除中发挥了重要的作用，直到今天，灭活疫苗仍然是成功防控FMD的重要措施，经过几十年的发展，FMD灭活疫苗在抗原生产、灭活、浓缩纯化、乳化等方面不断丰富和发展，在动物疫苗生产中已形成具有示范性的工业化生产体系。

目前，世界上FMD灭活疫苗生产和应用的主要有BEI灭活油佐剂疫苗和甲醛灭活铝胶皂素疫苗，对于灭活疫苗的质量控制上，更注重于疫苗的生物安全和免疫效力两个方面，因此，近些年来，FMD研究机构和生产厂家将力量集中到抗原生产工艺、灭活剂选择、浓缩纯化、佐剂以及生产过程疫苗效力的替代检验等关键技术的研究。

2.FMD灭活疫苗历史纵观FMD疫苗的研究和应用历史，FMD疫苗经历了灭活疫苗、活疫苗、灭活疫苗、新型疫苗这一历史进程和发展趋势。

而灭活疫苗从最初的舌皮组织毒经甲醛灭活制成的疫苗到后来的细胞培养病毒经BEI灭活制成疫苗，经历了20年的时间。

FMD病毒抗原生产方式也主要有三种方式: 牛舌皮组织生产的Frenkel培养方法；转瓶BHK21细胞单层培养法；BHK21细胞悬浮培养方法，转瓶单层培养方法是劳动密集型生产方式，生产过程生物安全较难控制，容易散毒,而悬浮培养法属于技术密集型生产方式，制备病毒抗原快速便捷，能很好的保持生产过程生物安全，是目前疫苗的主要生产方式。

截止2011年年初,我国已有两个国家指定口蹄疫疫苗企业采用了悬浮工艺生产口蹄疫疫苗。

该工艺的推行势必会给口蹄疫疫苗的生产甚至动物疫苗的生产的工艺带来巨大革新，也势必会促进我国兽用疫苗质量的巨大提升。

有报道称目前我国的口蹄疫疫苗质量及检验技术已达到世界水准。

2.1组织舌皮毒该方法制造的FMD灭活疫苗最早可追溯到上世纪20年代。

1926年，法国科学家Vallee等发现FMD病毒经甲醛灭活后，仍具有免疫原性，但工艺不好控制，灭活的病毒要么留有残毒，要么失去了免疫原性。

1939年，丹麦科学家Schmidt发现氢氧化铝胶体具有无毒性和免疫刺激的功能。

1937年，德国科学家Waldmann首次将病毒的灭活与乳化引入到FMD疫苗生产中来，获得了符合实际应用的FMD疫苗-铝胶甲醛灭活疫苗。

1947年，Frenkel等首次采用牛舌上皮细胞培养FMDV获得成功，为抗原的大量生产提供了经济、稳定的途径，该疫苗在欧洲FMD防控中发挥了巨大的作用。

但这种疫苗制苗材料来源不易,生产和应用受到限制。

2.2 单层细胞培养毒Frenkel等培养系统建立以后，组织培养学快速发展，原代细胞培养体系也迅速建立起来，1960年，利用转瓶培养体系建立的牛肾细胞原代培养建立起来，紧接着，BHK21传代细胞系得到了应用，传代细胞比原代细胞具有较多的优点。

上个世纪60年代，人们就开始采用转瓶生产病毒，该工艺成熟度高，占地面积小，投资成本小等优点，因此许多国家建立了规模化生产工厂，截至到目前，我国仍然以该工艺为FMD疫苗主要生产方式。

然而，该系统劳动量大，生产过程难以保证生物安全和疫苗质量批次不稳定等因素，几乎在发达国家停止应用。

1967年，人们利用微载体系统建立起了BHK21细胞悬浮培养体系，在实验室的体系得到了批量化的生产。

尽管如此，微载体由于其成本和系统的复杂性在FMD疫苗的应用上没有得到工业化应用。

2.3悬浮细胞培养毒1962年，人们发现BHK21细胞能全悬浮培养，细胞在此体系中增值速度很快，在较短的时间便可以达到工业化量。

1985年，这种体系被广泛的用在FMD疫苗生产中。

至今，世界上已经有5000L的发酵罐在应用。

细胞在一定浓度的小牛血清和MEM培养基中，密度在2～3d 即可增加到5×106个/ml或更高。

悬浮培养在FMD疫苗生产中处于核心地位。

1965年，生物反应器悬浮培养最早用于口蹄疫疫苗生产，当时的生物反应器容积是30L。

1983年，英国Wellcome公司就已能够利用5000L的细胞罐大规模生产口蹄疫疫苗。

目前，商品化的生物反应器已经可以达到20000L，大大提高了疫苗的生产效率和疫苗的质量，降低生产成本。

悬浮系统的应用，使无血清悬浮培养成为疫苗生产过程的主要工艺之一。

通过用已知人源或动物来源的蛋白或激素代替动物血清进行细胞悬浮培养，能减少后期纯化工作，提高产品质量，在实际生产不仅能够减少生产中污染几率，而且还能避免血清中潜在的一些病原微生物影响细胞培养或者对疫苗使用者造成威胁，也便于在生物反应器中进行代谢流分析，实施在线过程监控，精确投料。

无血清产品更加符合国际GMP要求，对我国FMD疫苗走向国际市场具有重要的现实和长远意义。

3.FMD疫苗生产和使用中的关键要素3.1病毒种子一般来说，一个好的疫苗毒株应该选择流行株，但是流行株不一定能够作为疫苗毒株来使用，首先疫苗毒株必须适应细胞，保持其毒力、抗原性稳定，而且其抗原谱必须广，能够保护大多数流行野毒的攻击。

因此，必须满足上述条件的流行毒株才可以作为疫苗候选毒株。

随着现代分子生物学的发展，基因序列分析在病毒流行病学研究上的具有重要的作用，序列测定在评价疫苗株与流行毒株亲缘关系方面具有重要的参考价值，然而这种方法对筛选疫苗候选毒株作用不大，在疫苗毒株的筛选中，应更多的采用血清中和试验和阻断ELISA方法，r值是评价疫苗株与流行毒株抗原关系的主要指标。

由于FMD容易发生变异，相关机构应定期分析本国或本地区疫苗株与流行毒株的抗原关系，以期选择适合的疫苗去防控FMD。

选定的毒株必须在单层细胞或悬浮细胞上连续传代，以期达到稳定的生长状态，病毒在不同种类和生长状态的细胞适应力是不同的，一般来说，病毒在单层细胞上生长的状态要明显的好于悬浮细胞，这种结果可能与细胞的生长状态有直接的关系，这就要求病毒在制作种子批的时候，应事先在单层上传代，待病毒表现出良好的生长状态时再用传代细胞生长。

然而，在疫苗制造过程中，因传代会导致毒株的变异，因此，应尽量减少病毒的传代次数，在研究和工业化生产中，应建立规范的种子批制度，我国病毒的种子批分为原始种子批、基础种子批和生产用种子批，基础种子批毒种必须经过严格的检验，由基础种子批到疫苗成品的毒种代次应不超过5代。

3.2细胞及用于细胞培养的培养基适应于FMDV生长的细胞除常用的BHK21细胞，还有IBRS细胞。

一般来说，尽管BHK细胞来源于同一种组织，但是根据其传代历史，不同的细胞株对病毒的适应能力是不同的，有的细胞对病毒敏感，有的细胞不敏感。

根据世界疫苗制造工艺的发展趋势，能较好适应悬浮培养，短时间内大量增殖和支持病毒良好生长的悬浮细胞系是FMD工业化生产所必需的。

在细胞培养中培养基的选择优化尤其是血清的类别对细胞的生长和对病毒的敏感性尤为重要，需要具体技术人员不断摸索、不断选择和优化。

4.疫苗生产关键过程控制4.1细胞及病毒培养能够很好的支持病毒生产和稳定传代的细胞是疫苗生产的关键步骤之一，在现代FMD疫苗生产过程中，一般采用BHK21细胞悬浮培养工艺生产FMD疫苗。

通常MOI为0.01即可在20h内使90%的细胞发生细胞病变。

（MOI：感染比即1个感染单位/100个细胞使用）4.2灭活及灭活检验病毒灭活及灭活检验在FMD疫苗生产中是最关键的步骤之一，历史上一些疫病的暴发与FMDV灭活不彻底有直接的关系。

最早，人们采用甲醛灭活FMDV，甲醛通过病毒蛋白交联而灭活病毒，对病毒核酸没有改变，其灭活动力曲线难以确定，难以确定病毒何时灭活完全。

随后，氮丙啶类如AEI被用于病毒灭活，该类灭活剂作用于病毒核酸，抗原蛋白不受破坏，能很好的保持病毒的免疫原性，但毒性较大。

目前，BEI是FMD疫苗生产的主要灭活剂，这种化学试剂灭活病毒能绘制出清晰的病毒灭活曲线，符合一级灭活动力曲线，对病毒安全，能保证病毒的抗原性，而且灭活彻底。

对于不稳定的疫苗株而言，采用甲醛和BEI共同灭活工艺能够显著降低灭活的时间，可由原来的40h 降低到8h左右，而且更加安全。

2008年出版的《OIE陆生动物卫生法典》中建议，FMDV灭活采用0.3mM BEI浓度2次灭活，一般来说，为了彻底的灭活病毒，不使病毒逃逸，在工业生产中，一般要将一个灭活罐倒到另一个灭活罐。

灭活抗原的安全性通过敏感单层细胞或乳鼠传代试验证实。

将灭活的抗原液接种到单层细胞，连续传代2-3代，无CPE；样品接种乳鼠后，连续观察7日，应全部健活。

10000L病毒悬液中的活病毒粒子应少于1个。

4.3抗原浓缩和纯化灭活疫苗刺激有效的免疫应答需要大量的抗原量，而且病毒增殖过程中的副产品如血清蛋白和病毒的非结构蛋白都会造成免疫动物的过敏反应。

因此，通过离心或沉淀等方法去除细胞碎片或者在接种病毒前将含血清培养基换成无血清培养基培养病毒。

4.4乳化乳化是为了提高疫苗的免疫原性，将灭活好的抗原与佐剂以一定比例混合。

一般常用的免疫佐剂有氢氧化铝胶、皂甙和油佐剂。

最早采用的佐剂是氢氧化铝胶佐剂，在抗原中加入氢氧化铝佐剂，氢氧化铝佐剂和皂甙用于FMD疫苗，该类疫苗能显著的保护牛免受FMDV的攻击，但对猪的免疫保护力相对较低，这种疫苗在中东和亚洲部分地区仍在使用。

1945年，油佐剂开始应用于FMD疫苗，油佐剂疫苗对牛和猪均能产生良好的保护力，疫苗的免疫持续期长，并且在其中加入Tween-80，降低疫苗的黏度，黏度小、稳定性好和乳化简便的油佐剂一直在不断的发展和改进，如ISA206以及近些年来发展起来的“即用型”（Ready-to-use）油佐剂，将逐渐取代铝胶和皂甙等传统佐剂。