植物无糖组织培养技术的研究进展及应用杨长友20111109035（生物化学与分子生物学，生命科学学院，重庆师范大学，重庆401331）摘要：植物无糖组织培养作为一种新型的组织培养模式可以有效地防止污染并能显著地促进组培苗的生长，尤其是增强组培苗的生根能力。
植物无糖组织培养目前的研究重点在于CO2浓度调节、培养基质的改进以及新型培养容器的研制等方面。
到目前为止，无糖组织培养技术已经成功地应用于多种植物的组织培养当中。
虽然现今无糖组织培养技术还存在前期投入较大、对设备的要求相对较高等问题，但随着研究的不断深入，无糖组织培养技术将在植物工厂化、规模化生产中发挥重要的作用，应用前景将会越来越广阔。
关键词：无糖组织培养；培养容器；培养基质；应用植物组织培养技术的优点在于快速繁殖、脱去病毒和种质资源保存，其中应用最为广泛的是快速微繁殖。
但由于在传统的组培技术中使用的是含糖培养基，杂菌很容易侵入培养容器并在培养基中繁殖，造成培养植物的污染。
为了防止杂菌侵入，我们通常采用密闭性很强的容器, 置于一定的光照条件下以一定的明暗周期恒温培养，组培苗依靠培养基中的糖进行异养生长。
但培养容器内通常气体流动性差，相对湿度高，CO2浓度不足，使培养植物生长缓慢，并且容易出现形态及生理异常，同时也大大提高了人工费用[1]。
以上诸多不利因素都严重制约了组培技术的发展及推广。
为了解决组培技术中存在的这些问题，20世纪80年代末，日本千叶大学古在丰树教授发明了一种全新的植物组织培养技术——无糖组织培养技术[2]。
他首先研究发现容器中的小植株也具有光合自养能力, 从而考虑改变植株的营养方式以CO2作为植株的碳源，同时改善植株的生理和能量代谢，使植株更好的发挥自身的光合能力，降低生产成本[3]。
无糖组织培养技术将环境控制技术和组培技术有机的结合起来，在环境因子的调节、培养基质以及培养容器等方面较传统组织培养有很大的改进，利用工程技术手段调控组培微环境的空气、光照、湿度等影响因子，使植株的生长环境更接近于自然状态，以达到促进植物体自养生长，提高幼苗的质量和产苗率，缩短培养周期的目的[4]。
1996年，无糖组织培养技术开始引入我国，并逐渐得到应用。
它是一种全新的植物组织培养技术，该技术的应用打破了传统组培必须用糖的观念，有效地提高了组培苗的生根率和移栽成活率[5]。
1 植物无糖组织培养技术的概念植物无糖组织培养技术（Sugar-free micropropagation）又称为光自养微繁殖技术，是指在植物组织培养中改变碳源的种类，以CO2代替糖作为植物体的碳源，通过输入CO2气体作为碳源，并采用微环境控制技术控制影响组培苗生长发育的环境因子，提供适宜植株生长的温度、湿度、光照、气体、营养等条件，促进植株光合作用，使组培苗由兼养型转变为自养型，进而生产优质种苗的一种新的植物微繁殖技术。
植物无糖组织培养技术是环境控制技术和组织培养技术的有机结合，又称为光自养微繁殖技术（Photoautotrophic micropropagation），该技术是由日本千叶大学的古在丰树教授于1980年提出和发明的，目前已经受到广泛关注，在许多国家和地区得到了推广应用。
2植物无糖组织培养技术的特点及优势2.1 植物无糖组织培养技术的特点2.1.1 CO2代替了糖作为植物体的碳源在传统的植物组培快繁技术中，小植株以糖（如蔗糖、白砂糖、果糖等）作为主要碳源进行异养或兼养生长，糖被看作是植物组织培养中必不可少的物质。
而无糖组培快繁技术中则用CO2替代糖作为小植株生长的唯一碳源，通过自然或强制性换气系统供给小植株生长所需CO2，使其在人工光照下，吸收CO2进行完全的自养生长，在一定程度上避免了微生物的污染。
2.1.2 培养容器的改变在传统的组织培养中，由于培养基中糖的存在，为了防止污染，一般使用或者说只能使用小的培养容器。
而无糖培养在培养过程中不使用糖及各类有机物质，极大地避免了污染的发生，使各类大型培养容器的使用成为可能，可以根据培养材料和生产规模的需要选用不同规格的培养容器，小至试管，大至培养室。
2.1.3多孔的无机材料作为培养基质在传统的组织培养中，通常使用琼脂作为培养基质，它的透气性差，不利于水分、气体和营养物质的移动和吸收。
无糖组织培养在基质的选择上相对广泛，主要是一些多孔的无机基质，如蛭石、纤维、珍珠岩、成型岩棉、石沙子等，这些基质具有良好的透气性，可以极大地提高小植株的生根率和生根质量[6]，而且与琼脂相比，这些无机基质价格相对低廉，节约了培养成本。
2.1.4环境控制促进植株的光合速率在传统的组织培养中，很少对植株生长的微环境进行研究，研究的重点是放在培养基的配方以及激素的用量和有机物质的添加上。
而无糖组织培养技术是建立在对培养容器内环境控制的基础上，根据容器中植株生长所需的最佳环境条件（如光照强度、CO2浓度、环境湿度、温度、培养基质等）来对植株生长的微环境进行控制，最大限度地提高小植株的光合速率，促进植株的生长。
2.2植物无糖组织培养技术的优势植物无糖组织培养技术理论上适用于所有植物，包括木本植物、草本植物、藤本植物、C3植物、C4植物和CAM植物。
到目前为止, 植物无糖组织培养技术已经在60 多种植物上取得成功，昆明环境科学研究所对非洲菊、康乃馨、满天星、彩星、勿忘我、彩色马蹄莲、洋桔梗、草莓、菠萝、马铃薯、甘蔗、甘薯等多种植物进行了无糖组培快繁的研究，并取得成功[7]。
植物无糖组织培养技术与传统的有糖培养相比，无糖组织培养技术显示出其特有的优势：（1）通过人工控制动态调整优化植物生长环境，为种苗繁殖生长提供最佳的CO2浓度、光照、湿度、温度等环境条件，促进了植株的生长发育，苗齐、苗壮；（2）继代与生根培养过程合二为一，培养周期缩短了40%以上；（3）大幅度减少了植物繁殖生产过程中的微生物污染率；（4）消除了小植株生理和形态方面的紊乱，种苗质量显著提高；（5）植株的生根率和成苗率显著提高，特别是对于木本植物来说，无糖组织培养技术能显著改善根的质量，提高生根率，使得种苗驯化期间的成活率大幅度上升，并且使复杂的驯化过程得以简化；（6）节省投资，降低生产成本，与传统的微繁殖技术相比，种苗生产综合成本平均降低30%。
（7）组培生产工艺的简单化，流程缩短，技术和设备的集成度提高，降低了操作技术难度和劳动作业强度，更易于在规模化生产上推广应用；（8）培养不受培养容器的限制，可实现穴盘苗商业化生产，也可实现大规模容器自动工厂化生产。
3植物无糖组织培养技术的研究重点3.1植物无糖组织培养中CO2浓度的调控植物无糖组织培养的理论依据是容器内小植株具有的光合作用能力。
研究表明[8]，只要具有20mm2含有叶绿素的叶片，植物就能独立进行光合作用。
无糖组织培养技术的一个重要特征是由CO2气体代替糖作为碳源，以减少微生物的污染和促进小植株的光合作用。
Vyas 和Purohit研究发现[9]，以蔗糖作为碳源和CO2的气体环境都可以促进毛白杨试管苗芽的分化和生长，当碳源缺乏时，芽会出现褐化现象，并且在30d之内死亡；但是在10.0 g /m3的CO2浓度下，试管苗的生长状况比在3%的糖浓度下的生长状况好，在CO2和糖同时作为碳源并且CO2的浓度为0.6g/m3的时候，试管苗芽的生长速度接近于常规培养条件下的两倍。
李宗菊等[10]研究发现，在任何糖浓度（0 %、1 %、3 %）下，CO2富集处理的植株重量（包括干重和鲜重）随时间增加的量比非CO2富集处理的大，而无糖培养时，CO2富集处理的增重效果最好。
屈云慧等[11]研究发现，在彩色马蹄莲试管苗无糖生根培养中，1000 ~ 1200mg/L浓度的CO2已可满足组培苗正常生长光合作用的需求。
他们同时还发现CO2的初始通气时间对彩色马蹄莲试管苗的生根也有一定影响，最佳CO2初始通气时间为培养的第6天，较早通气的植株在培养后期普遍出现叶片发黄、植株生根率低等现象，通气时间较晚的小植株的各项观察指标均较低，植株生长缓慢，种苗质量明显较差。
3.2植物无糖组织培养中培养基质的改进与研究传统组织培养方式多以琼脂作固体培养基，基质的透气性差，不利于养分、水分和气体的移动。
在植物无糖组培中可用化学纤维、珍珠岩、纸卷、蛭石、塑料泡沫、石棉、陶棉、沙子等多孔的无机材料代替琼脂作培养基，由于其良好的透气性，可改善根际环境，促进小植株生根[12,13]，而且多孔的无机材料与琼脂相比价格低廉，可节约培养成本。
同时，在培养基中添加一定浓度的激素可促进植物无糖组培苗的生长。
3.3植物组织培养的新型培养容器研究在传统的组织培养中，通常采用容积较小的培养容器以降低培养基中糖引起的污染，但这些容器中的空气流动性一般较差，相对湿度较高，CO2浓度较低。
研究表明，较高的相对湿度可导致试管苗叶片的结构发生变化，蒸腾拉力降低，影响了组培苗的正常生长[14]。
在较高的光照强度和CO2浓度下，良好的空气流动性对组培苗的生长有促进作用。
而在组织培养暗期进行降低气温的变温管理，同时在培养后期适当降低相对湿度，可明显提高组培苗质量[15]。
据报道[16]，昆明市环境科学研究所开发的组培容器，依据日光灯管长度和培养架的宽度设定体积为120 L、培养面积为5610 cm2，能够进行多层立体式培养，可同时控制容器内的CO2浓度、气体流动速度、温度和相对湿度等指标，不仅解决了传统培养容器中空气流动性差的问题，降低了培养过程中的相对湿度，还有效地利用了光源和培养面积，降低了能量消耗和培养成本。
目前已有不少学者和公司致力于无糖培养法相关设备的开发。
例如，日本的古在丰树、材真纪夫等研发了组培容器换气的透气滤菌膜、营养液循环大型容器、侧光靠近照明技术及相应的光导纤维照明设备、新式全自动控制培养箱等。
1986 年Mousseau 首次对番茄组培苗进行了CO2富集处理，发现进行光合兼养的组培苗（基质中含糖）的干物质积累增加31%，而进行光合自养的组培苗（基质中不含糖）的干物重积累却增加了100% [17]。
4植物无糖组织培养技术的应用及存在的问题4.1 植物无糖组织培养技术的应用无糖组织培养技术由于具有降低污染率、适于大规模培养、成本低等优点，目前已经在许多植物中得到了广泛的应用。
4.1.1 无糖组织培养技术在花卉研究中的应用自20世纪中期以来，组织培养技术在花卉组培快繁领域开始得到广泛应用，在开发具有自主知识产权的花卉新品种、培育脱毒花卉种苗等方面都起到了至关重要的作用。
但与其它植物的组织培养一样，培养过程中出现的褐化、污染、生根率低和移栽成活率低也是制约某些花卉组培发展的瓶颈。
随着无糖组培快繁技术的逐渐成熟和推广，该技术在花卉组培快繁方面表现出了明显的优势，如云南省农业科学院花卉研究所科研人员对康乃馨、非洲菊、满天星、等植物进行了无糖组培技术研究。