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１材料与方法 １．１毒株来源本研究的Ａ（Ｈ３Ｎ２）亚型流感毒株 均为国家流感中心保存，病毒分离时间自２０１０年１ 月至２０１５年１０月。 １．２病毒ＲＮＡ的提取及基因扩增 公司ＲＮｅａｓｙ
Ｍｉｎｉ
些病毒进行序列测定时不工作。为了确保所有病 毒序列能够一次测通，对引物序列进行了优化，使
ｍｉｎ
即可完成纯化。因此更换试剂后，更加节省时间 及人力。
２．２
引物匹配性优化
（Ｈ，Ｎ：）亚型流感病毒进行全基因组测序，共测序 毒株３２０株，采样日期为２０１０年１月至２０１４年
５月。
在实验过程中，发现部分病毒未能通过一次 测序实验而获得全基因组序列，个别引物在对这
万方数据
主堡塞墅塑！堕压煎垂堂塑查！！！！生！！旦箜！！鲞筮！塑￡！！！！兰！垦翌璺！堕！塑！！Ｑ！！！！！！！！！！：！！！：！！！塑！：！
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ
上游引物名称
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒｓ ＰＢ２—．Ｈ３—．Ｆ—．１ Ｂ ＰＢ２—．Ｈ３——Ｆ＿４２２
ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒｓ
ＰＢ２．２ ＰＢ２．５ ＰＢ２．７ ＰＢ２．１０ ＰＢ２．１２ ＰＢ２．１５ ＰＢｌ．１ ＰＢｌ．５ ＰＢｌ－７ ＰＢｌ．１０ ＰＢｌ．１２ ＰＢｌ．１６ ＰＡ．２ ＰＡ－５ ＰＡ．９ ＰＡ．１２ ＰＡ．１５ ＨＡ．２ ＨＡ－６ ＨＡ．７ ＨＡ－９ ＨＡ．１１ ＮＰ．３ ＮＰ－５ ＮＰ．８ ＮＰ．９ ＮＡ．２ ＮＡ．４ ＮＡ．８ ＭＰ．１ ＭＰ４ ＭＰ＿６ ＮＳ．２ ＮＳ－６
ｗｅｒｅ
ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｕｓｅ ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ，１９４ Ａ（Ｈ３Ｎ２）ｖｉｒｕｓｅｓ
ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ
ｗａｓ
ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ
Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ
ａｌｌ Ａ
ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｆｕｌｌ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ
序列拼接采用ＤＮＡＳｔａｒ软件中的
Ｓｅｑｍａｎ程序。序列比对使用ＭＥＧＡ ５．０软件的
Ｃｌｕｓｔａｌ
Ｗ方法。
２
结果
２．１
纯化方法优化
ＱＩＡｑｕｉｃｋ
９６ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
产物纯化，每纯化９６个反应约４０ ｍｉｎ，如果样品 量增多，所需的纯化时间将加倍。 改进实验方法后，使用ＵＳＢ公司的ＥｘｏＳＡＰ—ＩＴ 虾碱酶纯化，此纯化方法在加入虾碱酶后可用 ＰＣＲ仪进行热反应，无论样品量多少，只需３０
ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１００３—９２７９．２０１６．０５．０１３
【摘要】
目的
对流行的季节性甲型Ｈ３Ｎ２亚型流感病毒进行全基因组测序。方法本文对
甲型Ｈ３Ｎ２亚型流感病毒测序过程中的ＰＣＲ扩增引物进行优化及精简，同时对ＰＣＲ产物纯化方法
进行了改进。使用优化后的３４对ＰＣＲ引物和优化后的纯化方法，对１９４株甲型Ｈ３Ｎ２亚型病毒进
行了测序。结果利用优化后的测序方法，可保证获得甲型Ｈ３Ｎ２亚型流感病毒的８个片段全基 因组序列，而且大大缩短了实验时间，节约了实验成本和人力。结论 我们应大力开展Ａ（Ｈ３Ｎ２）
亚型流感病毒的序列测定工作，及时发现病毒变异情况，以推选出与人群中的流行株更为匹配的疫
苗株。
【主题词】
流感病毒；Ｈ３Ｎ２亚型；测序；全基因组
ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．
【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】
Ｆｕｎｄ
Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ；Ｈ３ Ｎ２
Ｓｕｂｔｙｐｅ；Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ；Ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ
ｐｒｏｇｒａｍ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｍａｊｏｒ Ｐｒｏｊｅｃｔ ｏｆ Ｃｈｉｎａ（２０１４ＺＸｌ０００４００２－００１－００３）
Ａ（Ｈ３ Ｎ２）ｖｉｒｕｓ，８
ｏｆ
ｓｅｇｍｅｎｔｓ ｏｆ
（Ｈ３ Ｎ２）ｖｉｒｕｓｅｓ
ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ
ｗｅｒｅ
ｏｂｔａｉｎｅｄ．Ｔｈｉｓ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｒｅｄｕｃｅｄ ｔｈｅ ｔｉｍｅ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ａｎｄ ｓａｖｅｄ Ｗｅ ｓｈｏｕｌｄ ｃａｒｒｙ
４７ｌ・
为疫苗株和流行株的匹配性，这就需要我们大力 开展序列测定和分析工作，及时发现病毒变异情
况，推选出与人群中的流行病毒更为匹配的疫苗 株，为人群提供有效的保护。
表１用于季节性Ｈ３Ｎ２亚型流感病毒测序的ＰＣＲ引物
Ｔａｂ．１ 引物编号
Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ Ｐｒｉｍｅｒｓ Ｐｒｉｍｅｒｓ
ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｓｅａｓｏｎａｌ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ（Ｈ３ Ｎ２）ｖｉｒｕｓ 上游引物序列
站ｈｔｔｐ：／／ｇｓｃ．ｊｃｖｉ．ｏｒｇ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｍｓｃ／ｉｎｎｕｅｎｚａ选取 人甲型Ｈ３Ｎ２亚型扩增引物，再根据后续测序反应 结果进行引物优化。所有测序引物由大连宝生物公 司合成。 使用Ｑｉａｇｅｎ公司Ｏｎｅ
Ｓｔｅｐ ＲＴ—ＰＣＲ
Ｋｉｔ进行基
定了３４对引物，扩增的目的片段之间相互重叠，能 够覆盖整个流感病毒全基因组。
时间。
３
Ｓ，７２℃１ １．３
ｍｉｎ，循环３５次；７２
ｏＣ
１０ ｍｉｎ；４
ｏＣ保存。
ＰＣＲ产物纯化及序列测定ＰＣＲ产物纯化分
９６ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ
别使用Ｑｉａｇｅｎ公司ＱＩＡｑｕｉｃｋ
和ＵＳＢ公司的ＥｘｏＳＡＰ－ＩＴ，两种方法进行比较。测 序反应使用美国ＡＢＩ公司的ＢｉｇＤｙｅ
面揭示流感病毒的重配和变异规律。既往有研究者 曾公布Ａ（Ｈ３Ｎ２）亚型流感病毒测序引物，本实验室 对此方法进行了优化，可在１０ ｈ左右快速获得Ａ （Ｈ３Ｎ２）亚型流感病毒的全基因组序列，可用于流 感病毒的日常监测和研究工作，及时进行病毒进化 分析。
万方数据
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主堡塞堕塑Ｉ堕座疸垂堂盘查！！！！笙！！旦箜！！鲞筮！塑曼！也！苎！垦！Ｐ堡！！！！坐！！Ｑ！！！！竺！！！！！！！！：！！！盟！：！
４６９
．短篇论著
Ｓａｎｇｅｒ法测定季节性Ｈ３ Ｎ２亚型流感病毒全
基因组序列
李希妍 赵翔 谭敏菊
蓝雨 成艳辉
黄维娟
王大燕
舒跃龙Βιβλιοθήκη １０２２０６北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家流感中心卫生部医学病 毒和病毒病重点实验室 通信作者：王大燕，Ｅｍａｉｌ：ｄａｙａｎｗａｎｇ＠ｃｎｉｅ．ｏｒｇ．ｏｎ
Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１
Ｋｉｔ。由于ＰＣＲ引物已包含Ｍ１３接
结论
头，因此用于测序反应的引物为通用引物Ｍ１３。具 体方法参见文献［２］。
１．４序列分析
近年来，下一代测序（Ｎｅｘｔ—ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
ｓｅｑｕｅｎ－
ｃｉｎｇ，ＮＧＳ）技术相继出现并迅速发展成熟。ＮＧＳ 以高通量、低成本为主要特点¨。，不过，由于ＮＧＳ 技术相关的仪器费用较高，不利于广泛推广。而 １９７７年Ｓａｎｇｅｒ发明的双脱氧末端终止法，即第一 代测序技术，拥有较长读长（平均读长７００ ｂｐ）和 极高准确率（９９．９％）‘４１，对于少量测序仍是最佳 最初使用Ｑｉａｇｅｎ公司的 Ｋｉｔ滤膜法进行ＰＣＲ 选择。 目前有些实验室已有第一代测序平台，但是缺 乏有效的测序引物，不能得以充分利用，所以我们希 望共享我们优化后的测序方法。使用经过我们优化 的测序引物对Ａ（Ｈ３Ｎ２）流感病毒进行测序，其匹配 性更高，而且大大减少了ＰＣＲ扩增的数量，可以节 约成本。 流感病毒抗原性易变，传播迅速，每年可引起 季节性流行，并且在人群聚集的场所可发生暴发 使用８９对ＰＣＲ引物对Ａ 疫情。对孕妇、婴幼儿、老年人和慢性病患者等高 危人群的危害尤为严重，接种流感疫苗是目前预 防流感、降低流感疾病负担最有效的手段¨１。由 于流感病毒易发生抗原性漂移和抗原性转变，而 目前全球已上市的流感疫苗都不能克服流感病毒 易于变异的特点，影响疫苗免疫效果的主要因素
用Ｐｒｉｍｅｒ
Ｐｒｅｍｉｅｒ
５．０软件，根据已知病毒序列，设
计并更换了４对引物，分别为ＰＢｌ．５、ＰＢｌ—７、ＰＢｌ－８
和ＰＡ－１
１。
利用Ｑｉａｇｅｎ
２．３
引物数量优化
用８９对引物对Ａ（Ｈ，Ｎ：）亚
Ｋｉｔ试剂盒进行ＲＮＡ提取。从网
型流感病毒进行ＰＣＲ反应，再使用通用引物Ｍ１３分 别进行正反向测序反应，最终获得１７８条序列，拼接 后发现，每一核苷酸位点有４至９个测序反应。为 了节约成本，能够在最短时间内完成全基因组测序 工作，对测序所使用的ＰＣＲ引物进行精简。最终确
甲型Ｈ３Ｎ２［Ａ（Ｈ３Ｎ２）］亚型流感病毒于１９６８ 年引起了全球范围的流感大流行，此后一直在人群 中呈季节性流行。对流感病毒表面蛋白ＨＡ基因的 分析表明，与人群中流行的其他季节性流感病毒相 比，Ａ（Ｈ３Ｎ２）亚型流感病毒的进化和变异最为迅 速¨１。流感病毒是分节段的ＲＮＡ病毒，对流感病毒 全基因组８个基因片段的综合分析，可以进一步全
２．４
因扩增，反应体系为１０¨ｌ。具体操作方法参见试剂 盒说明书。ＰＣＲ反应条件为６０
ｍｉｎ；５０ ｏＣ ２０ ｍｉｎ；９５
ｏＣ
１
ｍｉｎ；４２℃２０
引物验证
使用筛选出的３４对引物对采样
ｏＣ
１５ ｍｉｎ；９４℃３０ Ｓ，５５℃３０
日期在２０１４年３月至２０１５年１０月之间的１９４株 Ａ（Ｈ，Ｎ，）亚型流感病毒进行测序，结果表明仅使 用此３４对引物，可以完成流感病毒所有８个片段 的全基因组测序，显著减少了实验成本和实验
ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ
Ｃｅｎｔｅｒ
ｆｏｒ
Ｄｉｓｅａｓｅ
Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ