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体内水 平。 ( 1) 无 细 胞 水 平 的 筛 选。 即 直 接 用 纯 化 的 FTase在 人 工反 应 体系 中 测 定化 合 物对 它 活性 的 抑制 作 用。 FTase活 性 测 定 方 法 有 多 种, 最 常 用 的 一 种 是 测 定 [ 3H ] 法呢基从 [ 3H ] FPP 转到 R as蛋白的 数量。 一个 酶活 力单位定义为: 1 h 内在标 准反应 条件下 ( 37 e , pH 7. 4 ) 把 l pmol法呢基转移到 R as蛋白上去的酶量。这种方法的 关键是要能够完全分离 标记的 反应产物, 分离的 方法 主要 有: 凝胶电泳 法、过 滤法、免疫 沉淀 法。 ( 2 ) 细胞 水平 的筛 选。目前人们 已 采用 各 种细 胞 模型 包 括 GPAL 酵 母突 变 株、R as细胞、H eLa细胞、蛙卵母 细胞 及人肿 瘤细胞 等。其 中 GPAL 酵母突变株应用较广, 手霉素 ( m anum ycin) 族抗生 素类的三种抑制剂 UCF- A、U CF- B、UCF - C就 是用这种 方法从链霉菌属中筛选 出来的; 利用 R as细胞筛 选是 以抑 制 Ras转化细胞的停泊非依赖性生长和单层培养生 长作为 合适指标; H eLa细胞模型是通过检 测 FT ase抑制剂引 起前 核纤层蛋白 A 在 H eL a细胞 中积 累的 数量, 来评 价抑 制剂 的活性。 ( 3 ) 体内 水平 筛选。可 利用 线虫、裸鼠 等进 行筛 选, 利用线虫筛选 FTase抑 制剂可 以通 过抑 制法 呢基 化抑 制 Let- 60 R as蛋白功能, 从而抑制发生了 gf突变的 C. e-l egans幼虫 M uv表型的发生, 并且具有 剂量依 赖关系, 可以 用来评价 FT ase抑制剂的活 性, 不过 线虫的 结构和生 理功 能毕竟远不及哺乳动物 复杂, 因 此这个模 型的实 用意 义还 有待于进一步研究。 4. 3 醛糖还原酶抑制剂的筛选
上海医药 2007年 第 28卷 第 3期
筛选酶抑制剂存在巨大 的潜力, 在未来相 当长时 间内 仍是 酶抑制剂新药的主要来源。植物源酶抑制剂筛选的难点就 在于植物粗提物中 / 假阳性 0结果 太多, 干扰 真正有效 成分 的筛选, 目前, 国外对此采 取了一 系列措 施, 筛选 前先 通过 纯化, 采用提取物 通过 H PLC 或固相 萃取后 结合 质谱 作出 化合物指纹图谱库, 与已有的经验数据库进行比较, 有新成 分的粗提物再进 一步进 行药 理活性 筛选, 再者, 他们 还可 以先将粗提物通过 HPLC来鉴别出是否存在吸收光 谱有特 征的化合物, 这样可以 减少筛 选的盲 目性 [ 2]。新 药筛 选的 化合物库中有 70% 左 右为 有机 化学 产物, 因此, 合成 药是 新药的主要来源, 将高通 量筛选 技术与组 合化学 和组 合生 物合成技术的结合, 实现了酶抑制剂大规模筛选, 是世界许 多大制药公司筛选酶抑制剂新药的主要渠道。
醛糖还原酶 ( AR )是多元醇通路中的关键限速酶, 抑制 它的活性能减少山梨醇 在细胞 内的堆积, 防止一 系列 糖尿 病并发症的发生, 因此, 筛选醛糖还原酶抑制剂是糖尿病新 药来源的重要途径。其筛 选也分 为体外 筛选 和体内 筛选: ( 1) 体外筛选。目前醛糖还原酶抑制 剂的体 外筛选主 要利 用高通量筛选, 即 直接用 纯化 的 AR 在 人工 反应 体系 中测 定化合物对 AR 活性的抑制作用。其 筛选方法 为: 以 DL甘油醛为底物, 还原型辅酶 Ò ( NADPH ) 为辅 酶, 建立 AR IS 的高通量筛 选模 型, 杨 喆 [ 10] , 彭 剑 等人 [ 11] 应 用 96 孔石 英 板, 建立了 AR 的 微量高通量筛选模型, 一个 酶活单位定义 为: 反应体系在 37 e , pH 6. 2下, 在 340 nm 处吸光度 每分 钟下降 0. 001为一个单位, 以不含底物的样品为 空白对照, 测试样品对 AR 的抑制活性, AR 粗酶抑制率按以下 公式计 算: I = ( $A对照 - $A样品 ) /( $A对照 - $A空白 ) 。 ( 2 ) 体 内 筛 选。主要采用动物模型向 动物给 药, 提取 分离血 浆中 的红 细胞, 体外测定红 细胞中 AR 的 活性。 目前 测定 红细 胞中 AR 活性的方法有: 柱层析法、荧光法和 EL ISA[ 12~ 。 14]
酶抑制剂筛选的研究进展
唐章勇 唐灿 ( 西华大学生物工程学院 成都 610039)
中图分类号: R 97Fra bibliotek文献标识码: A
文章编号: 1006- 1533( 2007 ) 03- 0117 - 03
20世纪 60年代 初, Um ezawa提出 了酶抑 制的概 念, 从 而将抗生素的研究扩大到酶抑制剂的新领域。酶抑制剂新 药发现的途径: 一是来源于天然化合物, 包括动植物和各种 微生物等, 二是化学合成物。在目前上市的药物中, 以受体 为作用 靶点的 药物占 52% , 以酶 为靶点的 药物占 22% , 以 离子通道 为 靶 点 的 药 物 占 6% , 以 核 酸 为 靶 点 的 药 物 占 3% 。因此, 酶抑制剂的开 发是新 药来 源的一 个主要 途径。 以酶为靶点开发新药 存在巨大 潜力, 今 后很长 一段时 间仍 然是发现新药的重要着手点。
2 酶抑制剂源 目前, 酶抑制剂主要 来源于 植物、微生物 和化学 合成。
微生物产生酶抑制剂是来源于微生物的初级代谢产物和次 级代谢产物, 研究最多的是放线菌, 也是产生微生物药物最 多的类群, 其中最 重要的是 链霉菌 属 ( strep tom yces) ; 细菌、 真菌也是酶抑制剂的重要药源微生物。除了传统的药源菌 筛选分离外, 研究人员 的注意力 更集中 到了各 种新的 微生 物类群中, 如海洋微生物、极端微生物 [1] 。自然界植物种类 丰富, 但仅有不 到 10% 被测 定过 某种 生物 活性, 从植 物中
1 我国酶抑制剂筛选的进展 我国对 酶抑制 剂的研究 起步较 晚, 始于 20世 纪 70 年
代末, 但是我国进行有计划、有规模的筛选还不到 10年, 以 前的工作没有成规模的化学合成作基础, 筛选分散, 随机性 大。只有最近一些年来, 随着高通 量筛选 和组 合化学 及组 合生物合成技术的结 合, 规模化 筛选药 物得到 了极大 的发 展, 国内许多单位相继开展了酶抑制剂的筛选工作, 福建省 微生物研究所、上海医药工业研究院、中国医学科学院医药 生物技术研究所、四川 抗生素研 究所等 对酶抑 制剂进 行了 大量研究。国 内最 为显 著 的是 对血 脂 调节 剂 HMG - CoA 还原酶抑制剂的研 究。高通量筛 选技 术的发 展, 是我 国筛 选酶 抑制 新药的 重大突 破, 1998 年, 中国 医学 科学院 药物 研究所引进了国内第一台微量闪烁计数 器 ( m icrop late scint illat ion & lu rm inescen se coun ter)对 96孔板进行快速的放射 性活性测定, 使放射免疫实验及放射配基实验自动化、微量 化, 实现了从整体动物模型向高通量筛选模型的转化, 为酶 抑制剂的大规模筛 选奠定了 基础。目 前, 国内 利用高 通量 筛选每周可筛选数万个化合物。
4 筛选方法 酶抑制剂筛选的方 法主要分 为体 内和体 外筛选, 体内
筛选即利用动物进行 筛选, 体外 筛选包 括体外 试管筛 选和 体外细胞筛选, 以下介绍几种酶抑制剂的筛选方法。 4. 1 HMG- CoA 还原酶抑制剂的筛选
HM G - CoA 还原酶是合成胆 固醇 过程的 限速酶, 抑制 其活性即可抑制胆 固醇的合 成, 从而 起降血 脂作 用。其筛 选方法为: ( 1 )固醇 脂质 合 成的 同位 素掺 入 法 [ 8] 。用 鼠肝 微粒体或胞浆酶作为 粗酶制剂, 在反应 体系中 加入同 位素 标记的 合 成 前 体 如 [ 14 C] - 乙 酸 或 D, L - [ 14 C ] HMG CoA, 或 D, L[ 14 C ] - 甲羟 戊酸 作为 底物, 反应 后测 定 形成 的固醇中同位素的掺 入率, 样品 抑制固 醇脂质 合成能 力可 以通过与对照组数据对比求 得。 ( 2) 利用对 某些真 菌的抑 制活性及其用加酶催化产物 抵消试验 来筛选。 ( 3) 应用酶 联免疫吸附测定法将已知的 B- 羟 - B - 甲基戊 二酰辅酶 A (HM G- CoA ) 还原酶 抑制剂 com pactin 与蛋 白质交 联, 其 交联物免疫动物获得抗体。酶标抗体作为探针在发酵液中 定向寻找目标物。采用双抗体 法进行筛 选 [ 9] 。 ( 4 ) 动物实 验。用于进一步的活性测定, 方法是从大鼠尾静脉注射 tr-i tonW R - 1339盐水溶液, 注射后立即停止喂食, 并 持续使其 处于饥饿状态, 被检测 的大鼠 在注射 triton后 分几次 给药, 在注射 triton 24 h 后取 肝和 血浆 测总 胆固 醇和 甘油 酯, 评 价样品降血脂的效果 [ 8]。 4. 2 法呢基转移酶抑制剂的筛选
3 筛选模型 酶抑制剂的筛选模型分为三类: 整体动物水平模型、组
织器官水平模型和细胞分子水平模型。整体动物模型通常 效率低、耗费多, 筛选 的 样品 量多 而筛 选 出的 化合 物却 很 少, 并不适合作为药物 初筛的模 型。而组 织器官 模型 是药 物筛选的一大进步, 它在 一定程 度上克服 了整体 动物 模型 的不足, 减少了筛选样 品量, 降低 了劳动 强度, 扩 大了 筛选 规模, 减少了动物用量, 提高了筛选效率, 降低了筛选成本, 但是尽管这样, 还是存 在规模小、效率低、样品量 较大 等缺 点, 不易实现一药多筛。随 着酶和 受体作 为靶分 子的 阐明 及分子生物学和细胞生 物学技 术的发展, 分子药 理学 的不 断深入, 细胞分子水平药物筛选模型应运而生, 此模型克服 了前两者的缺点, 实现了大样本量的筛选和一药多筛, 已成 为目前药物筛选的主要 方法, 使 传统的手 工筛选 形式 转变 为由计算机控制的自动 化大规 模筛选的 新技 术体系, 从而 产生了高通量筛选 [ 3, 4] 。高通 量筛选 始于 20 世纪 80 年代 后期, 在 20 世纪 90年代后期得到极大发展, 已成为 酶抑制 剂新药发现的主要手段, 筛选快速、高效, 其筛选的过程为: 粗筛 y 复筛 y 深入筛选 y 确证筛选。其先进的检测方法使 每周筛选数万个化合物 成为可 能, 对酶抑 制剂的 筛选 大多 数情况测定酶活性即可检测, 其检测方法主要为: 放射免疫 检测 ( R IA )、荧光检测 ( FA )、闪 烁接近 检测 ( SPA )、比 色法 检测等。 F lotow 通过 放射 法已 成功 建立 了 P56kk激 酶抑 制 剂的高通量筛选模型。 Taft等 [ 5] 也 利用此 法建 立了 ( 1. 3 )