校准方法
• 将 Flow Check 在室温下放置 10 分钟 • 选择检测 Flow Check 的 PROTOCOL • 取 5 滴 Flow Check 放入试管，加等量蒸馏水或鞘液 • 将试管放在样品台上进样检测，取数 5000 • 记录荧光 FL1~FL3 的 HPCV 值，核对是否<3%，是否与以前记录相
DNA 倍体 2N 2N 2N~4N 4N 4N
DNA 分析中需注意的问题：
标本过滤 除使用 DNA-PREP 处理的全血标本外，任何标本均需要用 300 目
尼龙网过滤。 标准设置
由于 DNA 含量检测是一个相对量，所以必须利用已知 DNA 含量的 细胞(BECKMANCOULTER 公司的 INDEX，鸡红细胞、人淋巴细胞等)作为 标准。
Quanta SC 的滤片可互换，而且滤片有固定插槽，所以更换滤片后不 需校正光路
488nm 激光滤片标准设置
汞弧灯滤片标准设置
信号放大方式： 经过 PMT 将光学信号转变为电脉冲信号，并增加 PMT 的电压及
增益，可将脉冲信号进行放大。放大方式有两种： 线性放大(Lin):
AMP
对数放大(Log)
为了使其应用领域更加广泛，Quanta SC 配置有 2 个光源，488nm 的激光和汞弧灯，而且汞弧灯有 365、405 和 435 的激发波段，Quanta SC 的滤片可根据选择的染料不同随时更换，应用更加灵活。Quanta SC 的液流传输系统是注射泵，所以能精确测量通过样本的浓度。
Quanta SC 工作原理
第五课时 7，免疫荧光(三标记)，示范及练习(1~2hr) 8，质控品及质控介绍：
FlowCheck，FlowSet，CytoTrol，ImmunoTrol 9，总结及试剂介绍 第六-七课时 10，DNA 检测及分析：
检测原理，方案设计，标本制备（包括利用 488nm 激发 的 PI 和紫外激发的 DAPI），标本检测 11，数据保存和分析 12，熟悉软件中的其它选项 13，应用介绍
Quanta SC 概述
Quanta SC 是贝克曼库尔特公司最新推出的新型的多功能流式细 胞分析系统，Quanta SC 是第一台也是迄今唯一的一台具有库尔特体 积参数的流式细胞分析系统，它同时能检测 3 色荧光信号，而且还有 侧向散射光信号。Quanta SC 能不依赖荧光微球进行单平台绝对计数， 实现了在流式细胞系统上无成本的单平台绝对计数，另外还有两个独 特的荧光参数：荧光浓度和荧光表明密度。非常适合细胞学的科学研 究。
流式细胞术(Flow Cytometer)
流式细胞术(FlowCytometry,FCM)是利用流式细胞仪对细胞等 生物粒子的理、化及生物学特性进行分析的方法。它集中了单可隆抗 体技术、激光技术、计算机技术、细胞化学和免疫化学技术。利用流 式细胞仪可以对细胞等生物粒子的理化及生物学特性(细胞大小、DNA 含量、细胞表面抗原表达等)进行定量、快速、客观、多参数相关的 检测。
发出的相应波长光谱区别开。 二向色性长通滤片(DICHROIC FILTER) 一定波长以上的光通过，该波长以下的光被反射。45 度角放置
550nmDL
光源
通过光
反射光
>550nm 的光通过
<550nm 的光被反射
带通滤片(BAND PASS) 允许一定波长的光通过。
575nmBP
可以允许 545~605nm 的光通过
光源：激光，汞弧灯
多种激发光决定了应用的多样性。汞弧灯的 366nm 是激发 DAPI 和 Hoechst 等用于 DNA 倍体分析的理想光源，405 和 435 nm 可用 于检测 CFP。488 nm 激光的功率可调，2-22 mW，可根据检测信号的 不同随时调整，488nm 激发的染料有 FITC，PE，PI，7AAD，Syber Green，Syto 9，PC5，PC7，GFP，YPF，RFP 等。 流动室：专利的三角形流动室
例：用 DAPI 染色进行细胞周期检测分析
G0/G1
S G2/M
Region
G1 S G2
FL1 Mean
188.9
259.5 356.7
FL1 HPCV
3.54%
3.15% 0.57%
FL1 CV
4.00%
12.14% 3.90%
MCV 145 218 287
质控(一) 光路与流路校准
试剂
Flow Check 荧光微球(3X10ml) 直径：10um 光谱范围：525~700nm 浓度：1X106/ml 保存温度：2~8ºC 变异系数(CV)：HPCV<3%
光源：激光(488nm 固体激光)，汞弧灯（365nm，405nm，435nm） 流动室：专利的三角形流动室 液流传输系统：注射泵 细胞：单细胞悬液 检测器： 光电倍增管(PMT)，光电二极管 检测信号：电子体积（EV），散射光(SS)，荧光信号(FL1~FL3) 统计分析及结果输出： 计算机（Windows XP）
意义：
DNA 含量是随细胞增殖分裂周期各时相的变化而变化的。 DNA 含量正常与否以及各阶段细胞分化情况，可作为了解肿瘤恶 化程度和预后的重要参考，同时可探讨一些药物的作用机制等。
细胞周期
G0 期： DNA 合成静止期 G1 期： DNA 合成前期 S 期： DNA 合成期 G2 期： DNA 合成后期 M 期： 细胞分裂期
细胞在进入流动室之前已经经过流体力学聚焦形成分散独立的颗 粒，超稳定液流系统，精确的体积和荧光测定
检测器： 光电倍增管(PMT) Quanta SC 配置有 3 个非常敏感的ＰＭＴ
Voltage ：电压加于光电倍增管(PMT) 以增加敏感性 Gain: 光信号放大 光电二极管 检测侧向散射光信号
检测信号：电子体积（EV），散射光(SS)，荧光信号(FL1~FL3) 电子体积（EV）：库尔特体积
因 OptilyseC 中含有固定剂，故经该溶血素溶解的标本，可在 84 小时之内测定，待测标本置 4ºC 冰箱保存。
其他溶血素：氯化氨、草酸氨…… 不推荐使用蒸馏水
细胞周期分析
原理：
利用特殊的荧光染料(DAPI、Hoechst、PI、EB、AO 等)与细胞内 的 DNA 分子结合，这些染料经紫外（365nm）或 488nm 激光激发后， 会发出荧光，其荧光强度与 DNA 含量成正比。流式细胞仪通过测定细 胞的荧光强度推算出细胞的 DNA 含量。
过程，能够进行方案设计并能检测标本 5，掌握细胞存活率检测的原理及标本制备和检测过程 6，掌握单标记及多标记免疫荧光标记的原理及基本要点，
熟悉基本的标本制备过程，能够进行方案设计并能够检 测标本 7，了解并掌握仪器质控的几个步骤以及相关质控品 8，了解流式细胞仪的基本应用
培训内容及课时安排(每半天为一个教学课时) 第一课时： 1，Quanta SC 的基本原理及应用概述 2hr
多功能细胞分析系统 Quanta SC 培训教程
美国贝克曼库尔特有限公司 生命科学部细胞组学
Quanta SC 用户培训大纲
预期目的：通过第一次培训后能够达到以下要求： 1，了解 Quanta SC 的基本原理及不同于其它流式细胞仪的
特点 2，了解 Quanta SC 的基本结构、开关机程序及常规保养 3，了解 Cell Lab Quanta SC 软件结构并能运用各项功能 4，掌握 DNA 检测的原理及基本要点，熟悉基本的标本制备
Compensated
全血标本制备 (免疫标记—直标)
• 取 100ul 全血加入 12X75mm 试管中 • 加适量单抗(按抗体说明书所示) • 室温避光孵育 20min • 裂解红细胞
Optilyse C：加 500ul Optilyse C，室温避光 10min 加 500ul PBS，室温避光 10min 1500rpm 离心 5min，弃上清 1ml PBS 悬浮细胞，上机检测。
符。
注意
若 CV 值大于常规范围(>3%) • 观察仪器是否预热>20 分钟 • 按主机上 PRIME 键，排除气泡干扰后重测 • 选择 Cleaning Panel 清洗机器后重测 • 若以上处理均未达标，进行光路调整(工程师)
一种荧光染料不只发出一个波长，而是一定范围的波长。只是其 中一部分较其他染料“亮”。
带通滤片接收的是一定带宽波长的荧光，故会有干扰光同时被 接收，然后一同进入 PMT 进行光电转换并放大。
通常干扰光占该染料所发出荧光总量的 X%
如上图所示：FL2(575BP)在接收 RD1 的同时，亦接收了一部分 FITC(干扰)。这部分干扰占 FITC 总量的 X%。故真正的 FL2=实测 RD1(FL2)-干扰的 FITC(FL1)。即通常所说的：
结构及各部件功能： 激光，汞弧灯，流动室，注射泵，鞘液，光学系统，光 电倍增管，电压及增益，放大方式，阈值，检测信号种 类，荧光染料种类，分色方式，道数，直方图等 应用：科研 2，硬件及软件介绍 第二课时 3，开机步骤，按照操作向导提示进行，FLOW_CHECK 原理及 光路与流路校准操作，练习调电压，熟悉电压变化引起 的信号强度变化 4，练习建立方案 第三课时 5，免疫荧光(单标记)：原理，方案，同型对照设定，Q_PREP 或 OptiLyse_C 使用，CytoTrol 或 ImmunoTrol 及全血标 本制备，检测，练习调电压 (2~3hr) 第四课时 6，免疫荧光(双标记)：方案，同型对照设定，颜色补偿原 理及补偿设定，分别练习手动和自动调节，全血标本练习 (2~3hr)
库尔特（电子）体积不随细胞的形状改变而改变，也与细胞进入 流动室时的方向无关，所以用体积检测细胞大小更为精确。而且在细 胞直径稍有变化时，体积变化更显著，所以体积参数更为敏感。更容 易发现细胞的细微变化。
直径增长率
5%
25%
16%