– 打开下载的序列文件 batchseq.cgi
– 将输入的矩阵保存成NBRF 格式（File下拉菜单中的子 菜单“Export File”中的 “NBRF…”选项）
创建输入文件
▪ 由自行扩增的序列创建
– 运行MacClade软件，在“Taxa”下拉菜单“Import Sequences”选择“File with Only Sequence…”命令； 然后逐条地输入目的序列；
Related Terms
▪ The ingroup is the group actually studied by the investigator. That is, it is the group of interest.
Related Terms
▪ A sister group is the taxon that is genealogically most closely related to the ingroup. The ancestor of the group cannot be its sister because the ancestor is a member of the group.
▪ 排除非信息位点：选中“Data”下拉菜单中的 “Include-Exclude Characters”选项，排除“uninf”位 点
▪ 选择分析原则及搜索最佳树的参数设置：在 “Analysis”菜单中选中“Parsimony”；然后进行 “Heuristic”搜索；其参数设置是：
– General Search Options = Best trees only
– Plot type = Rectangular Cladogram
– Line width = 1.5 – Font = Helvetica – Size = 14 – Styles = Bold & Italic。
评价结果的可靠性
▪ 在得到树（或树集）后，必需做的是评价结果的 可靠性。主要有Bootstrapping方法。
– 将输入的矩阵保存成NBRF格式（File下拉菜单中的 子菜单“Export File”中的“NBRF…”选项）。
创建输入文件
序列的比对（Alignment）
▪ Positional homolog (点同源) ▪ 序列数据首先必需进行比对,以便能够对
同源位点（比较的单位）进行比较和分 析 ▪ 目前应用得最多的关于序列排序的软件 是Clustal X 1.81
– 用Sequencher（版本 3.1.1）、SeqScape或 BioEdit软件对测得的序列进 行校对和编辑，确保序列的 准确性
– 保存成FASTA或纯文本格式。
创建输入文件
▪ 由GenBank下载的序列 创建
– 运行MacClade软件，在 “File”菜单中选择“New File”命令
– 在“Taxa”下拉菜单 “Improt Sequences”选择 子菜单“FASTA File…”
Related Terms
Methods for Constructing Phylogenies
▪ 目前用蛋白质和核酸序列进行系统发育关系分析 的方法有：
– 距离法（Distance Methods） ▪ 其中邻接法（Neighbor Joining, NJ）最受欢迎
– 最大简约法（Maximum Parsimony, MP） – 最大似然法（Maximum Likelihood, ML） – Bayesian法
▪ 比对后，用MacClade 4.0软件打开排序后产生的 “.nxs”文件。手工校对排序的结果，并删除那些难以 比对的高变区（hypervariable regions） – Swofford等(1996)认为排除这些区域，可以提高系 统发育关系结果的可靠性。
系统发育关系分析
▪ 调用目的文件：运行PAUP软件；在“File”下拉菜单中 选择“Open”命令，找到从Clustal X排序后产生的 “.nxs”文件；点击“Execute”命令
▪ Bootstrapping（Felsenstein ，1985）用于评价 系统树各节点的支持率，通常支持率在90％以 上是最可信的。
▪ 在测试中共重复1000次。
评价结果的可靠性
▪ 选中Bootstra000
▪ Type of search = Full heuristic
– Internal nodes represent hypothetical ancestors
– Terminal nodes represent sequences or organisms for which we have data. Each is typically called a “Operational Taxonomical Unit” or OTU.
▪ Consensus tree options = Retain groups with frequency > 50%
评价结果的可靠性
▪ 点击Continue；在Heuristic Search的 Stepwise-Addition Options中的random 的# reps的值改为1000；点击Search
Methods for Constructing Phylogenies
▪ 用最大简约原则（Maximum Parsimony, MP）来推断 最好的系统树
– 理论依据：解释一个过程的最好假说应是假设条件最少的假 说。因此，对于分子数据（DNA序列数据），该方法计算在 最少的碱基替换条件下能够解释整个进化过程的拓扑结构 （系统进化树）。
– 简约原则在逻辑上的要求是在多种解释中选取最简单的。在 分析系统发育关系时，最简约的树是对数据集进化途径最短 的解释（即从祖先分类单元到现生单元性状变化的数目最少）
How to Create a Tree?
▪ The steps involved in creating a phylogenetic tree from molecular data are:
– Starting trees for branch-swapping = Get by stepwise
– Stepwise-Additon Options = random, # reps = 1000
– Swapping algorithm = TBR
系统发育关系分析
系统发育关系分析
▪ 合意树：在“Trees”菜单中，点击 “Compute Consensus…”，选中“Strict”， 点击“OK”，获取严格的合意树。
▪ 运算结束后，点击Trees下拉菜单中的 Print Bootstrap Consensus以打印结果
Bootstrap
100 64
74
100
100
93
100 67
Parsimony Tree based on ITS sequence
100
100 99
94 97
100 69
98 100
048DNA TT.t.atiayiyuuaanneennssies 030DNA T.hiromichii AF132506 T.ferrugineum 045DNATTT..s. osonngggssshhaanneennsseies 071DNA TT.s. osonnggsshhaanneennssies AY 112894 T.rufum AF132503 T.himalayense AF106883 T.indicum AJ583617 T.melanosporum AJ557530 T.borchii AJ557535 T.borchii AJ557520 T.maculatum AJ557517 T.maculatum T.sp2DNA RenT.15 AF003918 T.puberulum AF003917 T.dryophilum AJ557541 T.oligospermum AF106888 T.magnatum AF501262 Terfezia gigantea AF501260 Terfezia spinosa
Related Terms
▪ An outgroup is any group used in an analysis that is not included in the taxon under study. It is used for comparative purposes, usually in arguments concerning the relative polarity of a pair (or series) of homologous characters. The most important outgroup is the sister group, and considerable phylogenetic research may be needed to find the sister group. Usually more than one outgroup is needed in an analysis.
系统发育关系分析
▪ 赋根：在“Options”的下拉菜单中选中“Rooting”， 为树赋根；
– 有两种方案，①是Outgroup rooting；②是Midpoint rooting
系统发育关系分析
▪ 输出树：在“Trees”下拉菜 单中选择“Print trees…”以 打印树。
▪ 参数设置如下：
tree – Print (and perhaps publish) the results
获取相关基因序列数据
▪ Download from GenBank ▪ Sequenced by investigator
获取相关基因序列数据