引物3
5、基因扩增的诊断
常采用Southern印迹杂 交定量法
关于多态性分析
基因组的核酸分子碱基排列顺序 在同种生物的不同个体之间或等位基 因之间存在差异的现象称为基因多态 性。
DNA多态性可分为位点多态性 和重复序列多态性两种。
1、限制性片段长度多态性 （restriction fragment
（1） DNA序列测定 （2）核酸分子印迹杂交 （3）聚合酶链反应（PCR）
单链构象多态性检测PCR-SSCP 限切酶酶谱分析PCR-RFLP 随机引物分析 PCR-RAPD （4） DNA芯片技术
针对不同突变类型的基因诊断 技术
1、点突变的诊断 PCR结合点杂交 DNA芯片技术 限制性片断长度多态性分析法RFLP
正常男性 先证者
142bp 99bp
女性携带者 胎儿绒毛样品
2、DNA重复序列多态性分析
（三）基因表达异常的诊断 1、mRNA的定量分析 （1）相对定量
斑点杂交
RT-PCR （2）绝对定量
2、mRNA长度分析 Northern印迹杂交
RT-PCR
三、遗传病的基因诊断
1、直接诊断策略 2、间接诊断策略
（2）可使靶细胞变成稳定表达 目的基因的转化细胞；
（3）感染靶细胞后不扩散； （4）假病毒感染靶细胞的效率 非常高；
（5）不感染非增殖细胞。
4、安全性问题 （1）感染的可能性 （2）污染的可能性 （3）在靶细胞基因组中的整合
（二）腺病毒载体 1、结构
E1A E1B L1~L5 E2B
E3
E2A
E4
（四）转染靶细胞的筛选和导 入基因的鉴定
1、选择靶细胞应考虑因素 （1）组织特异性细胞； （2）易获得、寿命长 （3）离体细胞易受外源遗传物 质转化；
（4）易成活。
2、常用 靶细胞
（1）造血细胞 （2）皮肤成纤维细胞 （3）肝细胞 （4）血管内皮细胞 （5）淋巴细胞 （6）肌肉细胞 （7）肿瘤细胞 （8）其他细胞
矫正突变碱基，精确的原位修复 最理想，难以实现
(二)基因置换
指将特定的目的基因导入特定的细胞， 通过定位重组，以导入基因置换基因组 内的原有缺陷基因 基因打靶技术（同源重组）
（三）基因增补
1、概念 通过导入外源基因是靶细胞表达其本身不
表达的基因。 2、基因添加的两种类型 （1）针对特定的缺陷基因导入其相应正
常基因 （2）向靶细胞中导入靶细胞中本来不表
达的基因
（四）基因干预
采取特定的方式抑制某个基因的表达，或 通过破坏某个基因使之不表达
1.反义核酸技术 2.核酶 3.RNA干扰技术（RNAi)
三、基因治疗的基本程序
（一）目的基因的选择和制备
（二）靶细胞的选择
（三）基因的导入 （基因转移技术）
基因治疗的方式： 体内法：体内直接转移基因法
正常基因：设计寡核苷酸探针M GGTACGATGCGGTTAACGCG CCATGCTACGCCAATTGCGC
突变基因：设计寡核苷酸探针N GGTACGATGTGGTTAACGCG CCATGCTACACCAATTGCGC
MN
MN
MN
MN
杂交的结果：
（Ⅰ）受检者DNA与 N 杂交，与M不杂交：突 变基因纯合子
应用范围
1. 可快速准确查出致病病原体; 2.适于早期诊断、带菌带毒者和潜
在感染的发现； 3.大规模病原流行病学的现场筛查 4. 病原体抗药性的快速敏感试验; 5.对微生物的科属种进行准确分类
鉴定; 。
六 基因诊断在法 医学中的应用
PCR结合DNA指纹技术
Southern blot 应用
DNA指纹分析
第十六章
基因诊断与基因治疗 Gene diagnosis and gene therapy
基因诊断的概念：
以DNA和RNA为诊断材料， 应用分子生物学技术方法， 直接检查基因的结构、或表 达是否异常，对人体状态和 疾病作出诊断的方法。
用途——诊断下列两种类型疾 病：
1、内源基因的变异
2、外来生物的入侵
RT-PCR
C地中海贫血 珠蛋白基因3’端缺失0.6 kb
Bgl II
A C
Bgl II
（二）血友病A
factor VIII 基因缺陷（碱 基取代、缺失或插入等）
基因产物凝血因子VIII 无 活性或不稳定，导致凝血 障碍。
PCR扩增因子VIII基因 的18号外显子142 bp片段
Bcl I 限制酶 酶切位点在 基因内18号外显子3´端
（Ⅱ）与M、N都能杂交：突变基因杂合子 （ Ⅲ）与M 杂交，与N不杂交：没有这种突变
基因 （Ⅳ）M、N均不杂交：可能是新突变
（2）诊断未知的点突变
常用检测方法：
①PCR-SSCP ②DNA芯片 ③测序
①PCR-SSCP检测法 单链构象多态性
Single strand conformation polymorphism SSCP
2、特点 （1）能够进行位点特异性整合 （2）无致病性 （3）载体结构简单 （4）稳定 （5）不引起肿瘤形成
（四）单纯疱疹病毒载体 1、结构
ab
U1
b`a`c`Us c a
2、特点 （1）滴度高 （2）容量大 （3）增殖细胞和非增殖细胞均可感染 （4）不整合，但可长期存在并可稳定表达
基因转移的非生物学方法 （一）脂质体 （二）直接注射法 （三）受体介导基因转移技术 （四）其他方法
dsDNA ssDNA
高温变性，快速冰浴
野生型DNA 突变型DNA
点样孔
慢
快 SSCP原理示意图
2、少数核苷酸缺失或插入突 变的诊断
方法同点突变的诊断
3、大片断缺失或插入突变的诊断 常采用PCR法
致病基因 引物1 引物3
引物4 引物2
4、基因重排（染色体易位）的 诊断
常采用PCR法
引物1 引物2
抑癌基因p53的检测
1、常见突变类型： 点突变突变热点在5~8号外显子，有少量插 入或缺失
2、常检测方法 （1）PCR-SSCP （2）PCR结合序列分析 （3）PCR-RFLP
五、感染性疾病的基因诊断
目前应用最多是PCR法，不仅可检测病 原体的DNA（如乙肝病毒、巨细胞病毒、 乳头瘤病毒、结核杆菌等），而且可检 测RNA病原体（RT-PCR检测艾滋病病 毒、丙肝病毒等）。
MstⅡ酶
A T替换 CCTNAGG
CCTNTGG
HbA ---------CCT GAG GAG------MstⅡ MstⅡMstⅡ 1.1kb 0.2kb
HbS ---------CCT GTG GAG-------
1.3kb
SS AS F AA
1.3kb 1.1kb 0.2kb
RFLP法检测HbS (放射性自显影图谱)
基本原理 单链DNA在中性溶液中可形 成一定的空间构象，构象与其碱 基顺序相关。因此当单链DNA中 碱基变异时，如碱基替换，它的 空间构象也发生一定变化。这种 现象称为单链构象多态性。
单链DNA在非变性聚丙烯 酰胺凝胶中电泳时，其迁移率 不仅与链长有关，还与单链 DNA的空间构象有关，因此碱 基变异引起的构象变化也可改 变单链DNA的电泳迁移率。
其产物有详尽的了解，； （3）目的基因能在体外操作，能有效的导入靶细胞；能
在靶细胞中一段时间或长期稳定驻留； （4）导入基因能有适度表达； （5）基因导入方法和所用载体对靶细胞安全无害； （6）目的基因的表达不需严格控制，或能够人为控制； （7）人类的基因治疗需经过严格审批
二、基因治疗的主要策略
（一）基因修复或基因矫正
电泳染色,分析片段的 家系分布,作出产前诊断
142 bp 99 bp
父
母 儿 胎儿 ( 先证者) (女)
四、 肿瘤的基因诊断
一)肿瘤基因诊断的策略 1、检测肿瘤标记基因或mRNA 2、检测肿瘤相关基因 3、检测肿瘤相关病毒基因
（二） 肿瘤相关基因的检测
ras癌基因的检测
1、常见突变类型： 点突变（突变热点在12、13、61位密码子的 编码区） 2、常用检测方法 （1）PCR-ASO （2）PCR-SSCP
2、特点 （1）宿主范围广 （ 2 ）腺病毒蛋白表达不以宿主 增殖为必要条件 （ 3 ）可获得高病毒效价 （ 4 ）重组体非常稳定 （5）不会引起肿瘤 （6）有较高的安全性 （7）无包膜，不易被补体灭活， 可直接在体内应用 （8）不整合入染色体
（三）腺相关病毒载体 1、结构
ITR
ψ
REP
ITR CAP
AA:正常 SS:HbS纯合子 AS:HbS杂合子 F:被检胎儿
（2）RFLP间接分析法—— RFLP连锁分析法
甲型血友病 疾病种类：X染色体连锁性 遗传病 缺陷基因：凝血因子Ⅷ基因
主要临床表现：出血性疾病
应用PCR-RFLP连锁分析法 诊断甲型血友病
用一对引物扩增凝血因子Ⅷ
基因第18外显子内的一个142bp片 断，该片断含一个BclⅠ多态性位 点。酶解后，如果存在BclⅠ酶切 位点，则产生99bp和43bp两个片 断；如果不存在则只有142bp一个 片断。研究证明，142bp片断与甲 型血友病基因连锁。
① 限制酶识别位点发生单
个碱基置换位片断， 即多态位点的有或无。
② 限制酶识别位点之间的 DNA序列缺失、插入或重组， 限制酶识别序列不发生变化， 但它在基因组中的位置发生 了变化。这种多态性可以有 两个或两个以上的等位片断。
RFLP分析法 限制酶酶切图谱直接分析法 RFLP间接分析法
3.早期诊断：无临床表现 4.取样方便：不受组织时相限制 5.安全高效：不必培养高危病菌病毒，还可分亚型 6. 适应范围广：可检测内源性基因和外来基因。
二、基因诊断的内容和技术