高效液相色谱HPLC
20.2.4.高效液相色谱柱
色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定 相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光 滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管 用得较多。一般色谱柱长5～30cm，内径为4～5mm，凝 胶色谱柱内径3～12mm，制备往内径较大，可达25mm 以 上。一般在分离前备有一个前置柱，前置柱内填充物和 分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为 其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中 固定相，保证分离的性能不受影响。
需要指出的是每种色谱方法通常存在一种起支配作 用的主要保留机理，但可能还存在次要的其他机理。
根据固定相和液体流动相相对极性 的差别，有正相色谱和反相色谱两种色 谱体系或方法。
反相色谱和正相色谱主要区别是流 动相和固定相的相对极性，最初形成于 液液分配色谱，现已广泛应用于其他各 种色谱方法。
高效液相色谱HPLC
高效液相色谱HPLC
HPLC示意图
20.2. 高效液相色谱仪
高效液相色谱HPLC
20.2.1.流动相贮器和溶剂处理系统
现代高效液相色谱仪配备一或多个流动相储液器， 一般为玻璃瓶。每个储瓶容积500~2000mL。储液瓶位 置要高于泵体，以保持一定的输液静压差，在泵启动 时易于让残留在溶剂和泵体中微量气体通过放空阀排 出。
储器常装有脱除溶剂中溶解的氧、氮等气体装置， 这些溶解气可能形成气泡引起谱带展宽，并干扰检测 器正常工作。溶剂脱气主要有两种方法，其一是搅拌 下真空或超声波脱气；另一种是通入氦或氮等惰性气 体带出溶解在溶剂中空气。储液器的溶剂导管入口处 装有过滤器，以进一步除去溶剂中灰尘或微粒残渣， 防止损坏泵、进样阀或堵塞色谱柱。
20.1.3.高效液相色谱法分类和正反相色谱体系
上述每种色谱类型均可进一步分为多个不同色谱方 法。这些方法可用于分析分离，也可用于制备分离，各 色谱方法在相关领域应用互相补充。
高效液相色谱HPLC
20.2. 高效液相色谱仪
现代高效液相色谱使用3~10μm柱填料，为达到 适用的流动相流速，高压泵需提供几十MPa或数百大 气压力的柱前压。因而HPLC仪器比其他类型的色谱仪 要复杂和昂贵。
高效液相色谱HPLC
20.2.5.液相色谱检测器
l. 光吸收检测器：紫外吸收检测器，光二极 管阵列检测器，红外吸收检测器 2. 荧光检测器 3. 示差折光率检测器 4. 蒸发光散射检测器 5. 电化学检测器
高效液相色谱HPLC
20.3.高效液相色谱固定相和流动相
20.3.1. 高效液相色谱固定相 高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，
操作条件 1. 流动相对分离选择性的影响 2. 柱外效应 3. 操作压力
适用范围广
高效液相色谱HPLC
20.1.3.高效液相色谱法分类和正反相色谱体系
1. 吸附色谱(adsorption Chromatography) 2. 分配色谱(partition Chromatography) 3. 离子交换色谱(ion-Exchange Chromatography) 4. 体积排阻色谱(size Exclusion Chromatography)
3.柱恒温器
对色谱柱严格控制温度可获得重现性更高保留 值和高效更液相好色谱分HPLC离色谱图。
Hale Waihona Puke 20.2.5.液相色谱检测器
在液相色谱中，有两种基本类型的检 测器。一类是溶质性检测器，它仅对被分 离组分的物理或化学特性有响应，属于这 类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器 等。另一类是总体检测器，它对试样和洗 脱液总的物理或化学性质有响应，属于这 类检测器的有示差折光，电导检测器等。
高效液相色谱HPLC
20.2.2.高压泵系统
通用HPLC仪输液泵系统的基本要求是：提供(50500)×105Pa的柱前液压；输出无脉动恒定的液流；流 速范围0.1-10mL/min；流速控制精度0.5%或更好；系 统组件耐腐蚀(密封性良好的不锈钢或氟塑料)。高压 泵产生的液体高压没有爆炸危险，因为液体的压缩性 极小。最重要的是系统密封性能好。
薄壳型填料，柱效 仅每米1000~3000 塔板数
5~10μm球型和无定 型微粒硅胶，每米 5~6万理论塔板数
新型分离模式和 方法不断增加
高效液相色谱HPLC
高度均匀甚至单分 散1~3μm硅胶基质 球形填料，达15~30 万理论塔板/m。
20.1.2.高效液相色谱法的特点及与其他色谱法比较
基本特点 1. 高效、高速、高灵敏度、高选择性 2. 填料粒径和流动相性质影响色谱柱效 3．局限性
目前常使用的有三种类型的输液泵，即往复柱塞 泵、气动放大泵、螺旋注射泵，它们各有优、缺点。
往复柱塞泵
高效液相色谱HPLC
1.电机，2.往复凸轮，3.密封柱 塞，4.吸排液单向阀，5.溶剂入 口，6.脉动阻尼器,7.接色谱柱。
20.2.3.进样系统
进 样 阀
六口旋转进样阀示意图
高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约 5～30cm），所以柱外展宽（又称柱外效应）较 突出。柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的 峰展宽，主要包括进样系统、连接管道及检测 器中存在死体积。柱外展宽可分柱前和柱后展 宽。进样系统是引起柱前展宽的主要因素，因 此高效液相色谱法中对进样技术要求较严。
可分为刚性固体和硬胶两大类。刚性固体以二氧化 硅为基质，可承受7.O×108～1.O×109Pa的高压，可 制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧 化硅表面键合各种官能团，就是键合固定相，可扩 大应用范围，它是目前最广泛使用的一种固定相。 硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚 苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为 3.5×108Pa。固定相按孔隙深度分类，可分为表面 多孔型和全多孔型固定相两类。
高效液相色谱HPLC
20.2.4.高效液相色谱柱
1.色谱柱类型
按内径大小可大致分为常规分析柱、制备或半 制备柱、小内径或微径柱、毛细管柱四种类型。
2.保护柱
一般在分析柱前装上较短的保护柱，不仅可除 去溶剂中的颗粒杂质和污染物，而且可除去样品中 含有与固定相不可逆结合的组分，以保护较昂贵的 分析柱，延长使用寿命。
高效液相色谱法
(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)
高效液相色谱HPLC
20.1.1 高效液相色谱法的产生和发展
高压、高速的现代高效液相色谱仪于1967年面世， 导致高效液相色谱法(high-performance liquid chromatography，HPLC)的产生。