乳酸菌的分离培养保加利亚乳杆菌组长：组员：实验目的： 1.学习并掌握普通光学显微镜油镜的使用技术及微生物形态观察；2.学习微生物制片、染色的基本技术，掌握乳酸菌的简单染色法及无菌操作接种技术；3.通过对培养基的配制，了解配制培养基的一般步骤和方法，掌握微生物实验常用的器皿的清洗与包扎、培养基的制备、消毒灭菌。

4.了解各种灭菌的基本原理和应用范围，以及实验室中常用的灭菌方法。

5.了解酸奶中乳酸菌分离原理, 观察乳酸菌的基本形态,掌握用显微镜测微尺测量微生物细胞大小、数目的测定的方法。

6.了解稀释平板计数的原理，熟练掌握混合平板培养法。

明确显微镜计数的原理并学习使用血球计数板进行微生物计数的方法。

7．初步学会乳酸菌培养的基本技术，了解并掌握细菌鉴定中常用生理生化反应的原理和方法，掌握进行微生物大分子水解试验的原理和方法。

8.了解并掌握微生物菌种保藏的常用方法及其优缺点，并了解不同微生物对不同的生物大分子的分解利用情况，认识微生物代谢类型的多样性。

实验原理：乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称，本实验中用革兰氏染色法进行染色，革兰氏染色法是根据细菌细胞壁成分不同,脱色效果不同从而可以将细菌区分为G+和G-菌。

通过革兰氏染色以及形态学观察，乳酸菌呈紫色，为革兰氏阳性菌；乳酸菌应为乳杆菌和乳球菌的混合体。

酸奶中含有乳酸菌，而且目前市场上销售的酸奶中通常含有双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌四种菌。

细菌及其它一些微生物的大小，通常用测微计来测量，测微计分接目测微计与镜台测微计；培养基是按照微生物生长发育的需要，用不同组份的营养物质调制而成的营养基质；灭菌是用物理或化学的方法来杀死或除去物品上或环境中的所有微生物，包括芽孢；自然条件下，微生物常以群落状态存在，这种群落往往是不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物的特性或者要大量培养或者使用某种微生物，必须从这些混杂的微生物群落中获得纯培养，这些获得纯培养的方法称为微生物的分离和纯化。

用生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称之为细菌的生化反应。

实验器材：样品：含乳酸菌的酸奶①培养基：改良MRS固体培养基蛋白胨5g 牛肉膏5g 酵母提取物 2.5g 柠檬酸二铵1g 水500mL乙酸钠2.5g K2HPO4 1g MnSO4·4H2O 0.125 吐温80 0.5mL琼脂12.5g MgSO4·7H2O 0.29g CaCO3 5g 葡萄糖10g 。

仪器用品：500ml烧杯一个100ml量筒一个无菌培养皿12个250ml容量三角瓶2个5ml无菌移液管1ml无菌移液管6只15ml试管7只高压灭菌锅天平水浴锅一个玻棒一根旋涡均匀器一台镜台测微尺电磁炉一个棉花纱布目镜测微尺牛皮纸麻绳接种环一个盖玻片酒精灯一盏牛角匙pH试纸血球计数板载玻片若干恒温培养箱酸度计擦镜纸、吸水纸液体石蜡显微镜载玻片玻片架、洗瓶、酒精灯火柴、滴管药品：结晶紫，乙醇，草酸铵，碘，碘化钾，番红，KOH，NaCl，10％NaOH，2%氯化铁。

药品配制结晶紫：结晶紫乙醇饱和液（结晶紫2g溶于20ml 95%乙醇中）20ml，1g草酸铵于蒸馏水100ml。

将两液混匀即成。

卢戈氏碘液：碘1g，碘化钾2g，蒸馏水300ml。

先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，然后加入碘使之完全溶解，再加入蒸馏水300ml即成。

蕃红溶液：番红2.5g，95%乙醇100ml，溶解后存于密闭的棕色瓶中。

用时取10ml与80ml蒸馏水混匀即可。

0.1%的吕氏美蓝染液：A液：美蓝0.3g，95%乙醇300ml；B液：0.01% KOH 100ml。

混合A和B液即成，按1：100稀释即可。

生理盐水：称取0.9克氯化钠，溶解在少量蒸馏水中，稀释到100毫升。

实验步骤：一、培养基的培养1．称量用天平称取蛋白胨1g, 牛肉膏1g , 酵母提取物0.5g ,柠檬酸二铵0.2g,乙酸钠0.5g , K2HPO4 0.2g, MnSO4·4H2O 0.025g, MgSO4·7H2O 0.06g , 葡萄糖2g , 吐温80 0.1mL , CaCO3 1g放入烧杯。

2．溶解向上述烧杯中加入蒸馏水50 mL无菌水，用玻璃棒搅匀后，放到酒精灯上加热,在石棉网上加热溶解后,加入2.5g琼脂，并继续用微火加热。

在琼脂溶化的过程中，要控制火力的大小，并且不断搅拌，以免培养基溢出或烧焦。

待琼脂完全溶化后，补加蒸馏水至100mL。

3．调节pH 用滴管逐滴滴入1mol/L的NaOH溶液，边滴边搅拌，并随时用精密的pH试纸测pH，直到pH到6.8左右。

4．过滤要趁热用四层纱布过滤5．培养基的分装将培养基趁热分装到2个三角瓶里(一半为宜)。

注意：分装时不要将培养基沾在管口和试管上段，以免引起污染。

6．加棉塞培养基分装完毕以后，在管口上加一个棉塞。

棉塞能防止杂菌污染，保证通气良好。

加棉塞时，应使棉塞长度的2/3在试管口内。

7．包扎在管口外面包上一层牛皮纸，然后，用线绳扎好。

在每捆试管外挂上标签，注明培养基名称、配制日期和制作者姓名二、灭菌1．打开高压蒸汽灭菌锅，将里面的灭菌桶取出，向锅内加水(最好用开水)，水面与底架平齐为宜（直至高水位灯亮起）。

2．将扎好的试管管口向上竖放在灭菌桶内，再将灭菌桶放回灭菌锅。

（注意：灭菌桶内的物品不能放得太挤，否则会影响灭菌效果）。

3．加盖，并将排气软管插入灭菌桶的排气槽内。

（以两两对称的方式，同时旋紧相对的两个紧固螺栓，以防漏气）同时关闭灭菌锅上方的安全阀，打开排气阀，使水沸腾时得以排除锅内的冷空气。

4．设置灭菌温度和时间。

温度为121℃,20分钟灭菌5．排出锅内的冷空气，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升，当锅内的压力上升到98kPa 时，控制火力大小，使压力维持在98kPa左右20min。

6．灭菌所需时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力将至0时，打开排气阀，旋开盖子，取出灭菌物品。

三、无菌检查将取出的灭菌培养基放入37℃温箱保温培养24小时，经检查若无杂菌生长，即可待用。

四、菌悬液的配制先将酸奶样品搅拌均匀，用无菌移液管吸取样品10ml加入盛有90ml无菌水的三角瓶中，在旋涡均匀器上充分振摇20分钟，使样品均匀分散。

用一支1ml无菌吸管从中吸取1ml酸奶悬液注入9ml无菌水的试管中，吹息三次，使充分混匀。

然后再用一支1ml无菌吸管从此试管中吸取1ml注入另一盛有9ml无菌水的试管中，以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7各种稀释度的菌悬液（要取7只15ml试管）。

五、倒平板取无菌平板12个，编号标明10-1、10-5、10-6、10-7各三套；将经高温消毒的培养基冷却到50℃左右，按无菌操作法倒12只平板，每皿约15ml；平置使培养基均匀分布在皿底，待凝固。

六、分离方法A．涂布平板法用三支1ml无菌吸管分别吸取10-5、10-6和10-7的稀释菌悬液各1ml，对号接种于与之对应的3个无菌平板中，每个平皿放0.2ml；尽快用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂布均匀，平放与试验台上20 Min；然后倒置于40℃恒温箱中培养48小时。

B．平板划线1、划线在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，按无菌操作对标有‘10-1‘的3个平板进行划操作。

常用的划线方法有;(a)用接种环以无菌操作挑取菌液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线3-4条，再转动培养皿约70°角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分做第二次平行划线，再用同法通过第二次平行划线部分做第三次平行划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线。

划线完毕后，盖上皿盖，倒置于放在40℃恒温培养箱中培养48小时。

（b）将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续划线。

划线完毕后，盖上皿盖，倒置于放在40℃恒温培养箱中培养48小时。

C．稀释混合平板法先分别吸取1ml的10-5、10-6、10-7稀释度的菌悬液对号放入平板中，然后再倒入经高温消毒的并冷却到50℃左右培养基中，边倒入边摇匀，使样品中的微生物与培养基混合均匀，到冷凝成平板后，倒置于40℃恒温箱中培养48小时。

七、菌落特征的观察恒温培养48小时过后，取出培养平板；选择菌落分布较好的平板，先对其菌落形态（如菌落的大小、表面状况、透明度、色泽、边缘、隆起度、透光性、是否分泌色素等特点）进行观察，初步找出乳酸菌菌落。

乳酸菌的菌落很小，大约1~3 mm，园形隆起，表面光滑或稍粗糙，呈乳白色、灰白色或暗黄色；在产酸菌落周围还能产生CaCO3的溶解圈。

八、乳酸菌的形态观察及保加利亚乳杆菌的形态观察（一）普通光学显微镜的使用1.取镜从显微镜箱中取出显微镜时，用一手握镜臂，一手托镜座，直立移动，轻放在平稳的实验台上，使用前首先要熟悉显微镜的结构和性能，检查各部零件是否齐全，镜头是否清洁，做好必要地清洁和调整工作。

2.调节光照1) 用粗调节器提升镜筒，将低倍物镜旋到镜筒下方，使镜头和载物台距离约为5mm左右。

2) 上升聚光器，使之与载物台表面相距1毫米左右。

3) 插上电源，开开电源开关。

左眼看目镜调节反光镜镜面角度（在天然的光线下观察，一般用平面反镜；若以灯光为光源，则一般多用凹面反光镜）。

4) 开闭光圈，调节光线强弱，直至视野内得到最均匀最适宜的光度为止。

3.低倍镜观察1) 将载片标本（涂面朝上）置于载物台的标本夹上，并将标本部位处于物镜的正下方，转动粗调节器，使镜头下降至镜面距离检视物大约5mm处。

2) 然后以左眼看目镜，另一眼睁开，一边观察视野，一边扭动粗调节器使镜头缓慢地升高，至视野内出现物像后，改用细调节器上下微微转动，仔细调节焦距和照明，直至视野内获得清晰的物像，选择适宜部位，移到视野中心。

3) 移动推动器，换高倍镜观察。

4.高倍镜观察将高倍物镜转至镜筒下方，调节光圈和聚光镜，使光线亮度适中，再仔细反复转动微调螺旋，调节焦距，获得清晰物象，再移动推动器选择最满意的镜检部位将染色标本移至视野中央，待油镜观察。

5.油镜观察1) 先用粗调节旋钮将镜筒提升（或将载物台下降）约2cm，转动转换器将油镜转至镜筒正下方。

在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。

从侧面注视，用粗调节旋钮将载物台缓缓地上升，使油浸物镜浸入香柏油中，使镜头几乎与标本接触。

2) 左眼看目镜，右手反时针方向微微转动粗调螺旋，下将载物台，当视野中有模糊地标本物象时，改用细调螺旋，并移动标本直至标本物象清晰为止。

3) 观察完毕，下降载物台，将油镜头转出，先用擦镜纸擦去镜头上的油，再用擦擦镜纸蘸少许二甲苯或乙醚酒精混合液（乙醚2份，纯酒精3份），擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜纸擦拭2~3下即可，（注意向一个方向擦拭）。