斑马鱼胚胎整体原位杂交(Whole-mount in situ hybridizations in zebrafish embryos)北京大学遗传与发育生物学实验室整理者：肖安版本：V6.22 Build 2006-8-17说明：小号宋体文字为操作提示，其中下划线标记者为以下数步均需注意的内容；小号楷体文字为影响结果的重要步骤提示，注意控制记录其操作处理的条件和时间，以在重复实验探索最适条件时进行适当调整。

在整个实验中应当注意：(1) 由于环境中存在大量RNA酶，RNA在常温下极易降解。

因此，涉及RNA的操作，在探针去除之前，以及探针的合成与纯化过程，必须严格防止污染。

操作需要要戴乳胶手套进行，使用专用枪头、离心管、电泳槽等，尽量缩短RNA 在常温或37℃放置时间，电泳使用高电压短时间的程序，每次必须更换新电泳液。

实验间隙中RNA放置在-20℃，过夜或更长时间保存在-80℃。

(2)如同时对多管进行吸去溶液和加入溶液工作，应当按照同样的顺序依次操作，以保证其处理时间基本一致。

避免漏加溶液。

(3)注意所加溶液与胚胎温度的差异，应当先预热再使用。

一般溶液加入量为1mL左右，管平放以使胚胎分散与溶液充分接触，但探针杂交一步溶液过少可竖直放置。

(4)吸取胚胎的枪头应剪去尖端以扩大开口。

吸时动作要轻。

任何时候都要防止丢失胚胎，可在换前一管溶液时将后一管竖直放置让胚胎沉降一会以免吸走。

(5)注意保护标签，并且易混淆标签必须设法分辨(如6和9)。

第一天以下操作需戴乳胶手套。

1 水溶液体系重新处理 (Rehydration)。

1.1吸去恢复到室温的胚胎中的甲醇(MeOH)，用70%, 50%, 30%的 MeOH的PBST溶液依次处理5分钟。

梯度稀释的目的是防止胚胎收缩，可适当多添加几个浓度梯度。

稀释时间宁长勿短。

特别注意保护标签，MeOH为有机溶剂，易腐蚀油性笔书写的标签。

1.2 PBST处理5分钟，两次。

2 蛋白酶消化和随后的固定(Proteinase digestion and post fixation)。

2.1用蛋白酶K的PBST溶液(在管中原有的约1mLPBST中加入1uL10mg/mL的蛋白酶K，终浓度消化的目的是使探针更容易进入组织中。

应根据胚胎质量、以前原位杂交结果适当增减时间。

注意双氧水脱色的胚胎受损害较大，蛋白酶K处理时间应大大短于培育时加入PTU阻止色素生长的胚胎。

理论上换新的酶和新胚胎都应该重试处理时间。

以下操作室温进行，注意溶液预热。

2.2消化时间到后，先尽快用PBST暂时漂洗，然后PBST洗5分钟，一到两次。

在PBST洗后或下一步多聚甲醛固定后可以按照探针将胚胎分管和混合，注意同一管中的胚胎发育时期不宜相隔过近，以免最后观察结果时难以分辨。

但若相隔过远，后面的染色时间可能会有很大差异，并且处于发育较早期的胚胎破裂时卵黄可能污染发育较晚期的胚胎。

每一时期每一探针需15枚左右(发育早期的胚胎在实验中容易损坏，宜多取一些)。

若做正负对照，正对照用已明确的Marker基因探针(反义RNA链)，或者对胚胎进行双染。

负对照使用正义RNA链，或者不加探针(如粗略筛选时)。

注意及时写上新的标签编号并记录下每个编号对应的各胚胎时期。

2.3 4%多聚甲醛(paraformaldehyde, para)固定20分钟。

提前解冻，每次实验都尽量用一管新的多聚甲醛，避免RNase污染。

未使用完部分可用于固定胚胎。

用于原位杂交的胚胎都使用多聚甲醛固定。

甲醛苦味酸混合液固定胚胎虽然能更好的保持形态，但将破坏胚胎抗原性，导致零结果。

2.4 PBST洗5分钟，两次。

以上两步用PBST洗涤也可改为PBT，后者含有小牛血清，对胚胎保护更好。

以下65℃的操作步骤在水浴箱(water bath)或杂交炉(hybridization oven)中进行，注意溶液预热。

3 预杂交(Prehybridization)。

加入500uL HYB，65℃预杂交至少4小时。

4 杂交(Hybridization)。

4.1 RNA探针(RNA probe)以3ng/uL浓度溶于HYB，72℃温育5分钟，再冰上放置以破坏形成的可能妨碍杂交的二级结构。

4.2吸去胚胎管中的HYB，加入约含至少300ng 探针的溶液。

实际探针浓度应反复调整至合适。

通常加入体积为200uL，不得少于100uL，否则胚胎难以充分接触溶液。

4.3 65℃温育过夜或大约12小时。

杂交温度一定不得超过72℃，否则探针被破坏。

温度越低，杂交程度越好，但背景可能越深。

这是影响最终结果最重要的决定因素之一。

杂交时间不宜超过太多，否则背景容易过深。

第二天5 去除探针(Probe Removal)。

5.1吸去探针溶液并重新保存于-20℃。

一般而言探针可重复使用十次左右，能重复使用次数取决于探针质量。

使用越频繁，得到的信号越弱。

探针的HYB 溶液中在-80℃下至少可保存一年。

以下步骤不用戴乳胶手套操作。

以下操作步骤仍在65℃进行，注意溶液预热。

5.2甲酰胺(formamide)溶于SSCT的溶液(最终浓度甲酰胺50%，SSCT 2*)洗30分钟，两次。

5.3 2*SSCT洗25分钟。

5.4 0.2*SSCT洗30分钟，两次。

通常在试验时洗涤到此为止，若背景过深可继续一至多步洗涤，如0.1*SSCT65℃或室温洗涤15分钟，再0.05*SSCT 室温洗涤15分钟。

洗涤的目的是洗去残留未特异性结合的探针，留下特异性结合的探针，较高温度(65℃)或较稀浓度SSCT洗涤可洗得更干净，在降低背景同时也容易使杂交上的探针被洗脱，这是影响最终结果的最重要因素之一。

时间要严格控制。

实际需要反复探索适合于不同探针、不同时期胚胎的具体条件和时间。

第一次试验可只到0.2*SSCT洗涤。

从去除探针开始的步骤需要特别保护胚胎，因为胚胎此时非常透明(处于发育较晚期的尤其如此，可能是卵黄较少的缘故)。

吸取溶液时先将管竖直，待胚胎沉到管底后再吸溶液，并注意枪头中有没有吸走胚胎。

以下步骤(6-7)为针对双染的第一步或针对荧光素标记探针Fast Red染色。

若不做此步可直接跳至8。

8 地高辛抗体检测(Anti-Dig Detection)8.1慢摇下用MABT洗5分钟，两次。

8.2慢摇下用阻断溶液(blocking solution，参见现配溶液)阻断一小时。

此步可以在解剖镜下将损坏的胚胎清除。

若为双染，第二次阻断可略去。

8.3加入新用阻断溶液3000倍稀释的地高辛抗体(digitin antibody, anti-dig)，每管至少加入800uL，4℃下摇动过夜。

注意用于稀释抗体的溶液4℃预冷，避免抗体降解。

抗体不一定是单抗，有可能与胚胎中原有的其它抗原结合，导致背景过深。

在对实验结果精度要求较高的情况下，可将抗体与待原位杂交时期的胚胎或胚胎的丙酮保存粉末混合处理(参见现配溶液)，或者加入适当的阻断试剂。

第四天以下步骤最好使用另一摇床或停止加热的杂交炉，从4℃中取出的摇床要等内部凝结的水汽蒸发完后才能再次使用，以保护电路。

第四天同。

9 碱性磷酸酶底物染色(AP Substrate Stain)9.1加入到1%热处理羔羊血清(heat treated lamb serum)的MABT溶液中，室温洗25分钟。

9.2 MABT洗25分钟，三次。

9.3检测缓冲液(Detection Buffer，参见现配溶液)洗5分钟，二次。

胚胎转移到24孔板。

在转移之前可再挑一次损坏的胚胎。

24孔板孔内不能有灰尘，解剖镜下检查并用脱脂棉蘸乙醇擦干净，用检测缓冲液冲洗两次，一般使用一两次即抛弃。

各孔盖上标好探针名。

9.4加入至少300uL AP底物染色缓冲液(参见现配溶液)，室温温育，金属箔片包裹避光。

每30分钟检查一次染色情况。

万一需要过夜不便检查，4℃保存第二天再室温放置并检查。

尽量避免如此以防染色过度。

若染色液变色，说明已光照失效，应适当补充染色液。

温度低可以减缓酶促反应速度，而温度高染色快，但会使背景加深。

9.5当目标着色出现后，用PBS洗5分钟，两次，以停止反应。

此处PBS和杂交前使用的PBS分开，不加吐温以免干扰。

若同一孔中的不同时期胚胎染色情况不一致，可以分开分别终止。

10 照相(Photograph)10.1 4%多聚甲醛PBS溶液固定，保存于4℃。

地高辛探针杂交胚胎长期保存可依次用30%, 50%, 70%MeOH的PBS溶液处理后转移到MeOH中，4℃或-20℃保存；并不时检查更换变色的MeOH。

管的侧面和盖上注明胚胎品系、时期、探针、日期。

MeOH可溶解碱性磷酸酶非特异性着色和部分特异性着色，因此保存的胚胎颜色将逐渐变浅；而Fast Red着色在MeOH中将全部脱落，只能保存于多聚甲醛。

10.2照相前将胚胎用用30%, 50%, 70%甘油的PBS溶液处理后转移到甘油中，照相后再梯度转移回4%多聚甲醛或MeOH中。

不需保留可丢弃。

现配溶液(仅需稀释或混合者略)溶液名后附加的T表示吐温(tween)，用前加入，浓度约为0.1%。

吐温的作用是使胚胎不易粘附在枪头内壁上。

由于吐温量少且较粘稠，吸取的时候要多等一会让其上升至枪头内，加入后在溶液中吹吸几次。

(1)丙酮粉末处理抗体溶液每管800uL抗体溶液：取充分混匀的质量百分比约1%的丙酮鱼粉悬浊液11uL，4000rcf离心2分钟，去除上清。

加入500uLPBT洗涤，4000rcf离心2分钟，去除上清。

离心速度和时间须适当调整，既要保证沉淀上清分离，又要避免沉淀结合过于紧密无法重悬。

加入80uLPBT，震荡成悬浊液。

加入羔羊血清至2%终浓度(1.6uL)。

加入1/300的抗体，即得10*抗体溶液。

使用前用阻断溶液稀释至1*，即1/3000抗体溶液。

(2)阻断溶液(blocking solution)每1mL 10%热处理羔羊血清或100uL血清原液；2mL 10%阻断试剂(blocking reagent)；用MABT补至10mL。

1%热处理羔羊血清的MABT溶液类似，仅不加阻断试剂；可共用同一容器。

两种溶液若剩余均须丢弃，防止血清变质。

(3)检测缓冲液(detection buffer)又称AP缓冲液(AP Buffer)每50mL溶液：100mM NaCl(1mL 5M)；50mM MgCl2(2.5mL 1M)；100mM 三羟甲基氨基甲烷(Tris)-HCl(5mL 1M，pH9.5)；0.1% Tween-20；1mM 左旋咪唑(levamisole)(50uL 1M)。

左旋咪唑的作用是抑制胚胎组织内源性碱性磷酸酶，若不加左旋咪唑，可以增强信号，不过同时背景也会增强。

而若最终结果染色过浅，可能是左旋咪唑抑制了抗体结合碱性磷酸酶，应调整浓度。