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3、训练目标
创新小组成员能够初步掌握微生物发酵技术、分子生物学的基本操作，提高科 研课题实施所需要的文献查阅能力、阅读能力、分析文献能力。理论基础知识与科 学研究相结合，运用理论知识有效指导科学研究，在科学研究中进一步丰富、巩固 理论知识，并着重提高学生的科研创新能力，在小组成员进行具体的分工合作基础 上培养其团队合作的能力，最终成为面向社会的优秀创新人才。
四、预期成果 人才培养 项目执行期间，将提高创新小组成员的创新精神和实践能力，促进人才培养模 式和教学方法的创新。 研究结果 （1）通过对 argB 基因中的几个突变位点的选择，先进行单点突变，在酶活不 受影响的基础上确定突变位点对产物反馈抑制作用的解除或降低。 （2）获得定点改造过的 NAGK 再将其返回到高产精氨酸菌株钝齿棒杆菌中加强 表达，从而达到提高精氨酸产量的目的。 成果提交 成果提交 在《生物工程学报》或 SCI 等国内外生物工程类主流学术期刊上发表论文 2-3 篇；并提交项目进展报告和项目总结报告。
成
名 生物工程 业
34 /专 /
（1975.6） 程
导 师
生 工业 生物 成 863 工程
生物工
程 人 成
团队（IRT0532） 工业 08 年 工 年 人 年 （ 人） 3 项 完成 1项 科 60 Journal of Applied Microbiology SCI 12 生物 生物工程 工 30 2 专 8项 专 2 06 年 科 1 项 科生 生 程4门 精 程 生物 09 年 05 年 成 二 1 项
具有的特长兴趣以及小组成员获得的奖励 2 具有的特长兴趣以及小组成员获得的奖励
创新小组项目主持人蓝春燕同学： 2007-2008 学年江南大学优秀团员 2007-2008 学年江南大学艺术团优秀干部 2007 年四月志愿者活动的爱心大使 2008 年六月 k-park 挑战杯第五届江苏省创业计划竞赛优秀志愿者 2007-2008 学年第一学期生工学院十佳歌手
5、项目结题
本项目以发表高质量中文文章 1-2 篇、外文 1-2 篇、提交研究报告等进行结题。
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学校提供条件（包括项目开展所需的实验实训情况、配套经费、相关扶持政策 三、学校提供条件 等） 申请人所在的江南大学生物工程学院工业微生物中心及工业生物技术教育部重 点实验室具有良好的展开微生物学和分子生物学实验的基础，本实验中心拥有开展 该类研究所必须的仪器设备，包括梯度 PCR 仪，HPLC、GC、高速和超速冷冻离心 机以及超低温冰箱及其它微生物常规培养所需的全部仪器设备。生物工程学院中心 实验室具有的蛋白纯化系统及氨基酸分析仪、GC-MS、LC-MS 等仪器可满足对发酵 代谢产物的流量分析。 本项目是“863”计划课题“低能耗高产精氨酸工程菌构建及其发酵优化”的一 部分，同时也得到了江南大学生物工程学院“本科学生科研及创新计划”的支持。
申 请 人 或 申 请 团 队
名 人
所 /专业 生物工程 /生物工程 生物工程 /生物工程 生物工程 /生物工程 年
E-mail 132551157 73 15861674 198 158614411 22 lanchunyan@ 402920770@qq .com luyuanxiuhaha @
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4、组织实施、过程管理、实践环节、教师指导 组织实施、过程管理、实践环节、
本课题由一名大三本科学生和两名大二本科学生组成。每位成员对微生物和分 子生物学知识都有一定的了解，具有一定的创新思维并已熟悉部分实验操作，为该 创新课题打下了良好的基础。课题操作过程中，学生在阅读大量科技文献的基础上 可提出自己的课题思路，定期进行研究汇报分别以 PPT 形式及书面报告进行提交， 由指导老师进行修改，并及时掌握课题进展。实验操作过程中由研究生具体指导。 实践环节： 1、熟悉 NAGK 酶活的测定方法，并掌握利用 Ni-NTA 纯化酶的方法。 2、锻炼快速阅读外文文献的能力，参考已有的文献对突变点进行选择。 3、熟练掌握 PCR 的原理及具体方法，具有独自设计引物的本领。利用 over-lapping PCR 的方法对 argB 进行定点突变。 4、胶回收 PCR 产物，构建重组质粒，并进行核苷酸测序确定定点突变成功。 5、纯化定点改造后的突变 NAGK，对其酶学性质进行研究，测定 L-Arginine 对其酶 活的抑制作用是否解除或降低。 6、掌握电击转化钝齿棒杆菌的具体操作，获得重组钝齿棒杆菌，对其进行发酵结果 分析。
江苏省高等学校大学生实践创新训练计划项目申请表
项目名称 项目所属 一级专业门 项目类型 项目实施时间 起始时间 年级 科 年 级 科 二年 级 科 二年 级 钝齿棒杆菌精氨酸合成途径关键酶 NAGK 产物反馈抑制解除的定点 改造 工科 项目所属 二级专业类 （） 个人项目 2009 年 6 月 生物工程类 （√） 团队项目 完成时间： 2010 年 6 月
院系负责人签名：
学院盖章： 年 月 日来自八、学校推荐意见： 学校推荐意见： 推荐意见 同意申报！
学校负责人签名：
学校公章 年 月
日
8
签名： 年 月 日
7
七、院系推荐意见 系推荐意见 该创新小组由 3 名来自大学三年级和二年级学生组成，在大学期间，每位小组 成员都通过自我努力奋斗在学习、实践等方面取得了优异成绩，为该创新小组的建 立奠定了坚实的基础。小组成员参与了江南大学生物工程学院旨在培养本科生创新 能力的“本科学生科研及创新计划” ，小组成员在该计划中表现出一定创新能力以及 实验技能。同意推荐申报“江苏省高等学校大学生实践创新训练计划”项目，在更 高层面上提升本科生创新精神和实践能力。
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申请理由（包括自身具备的知识条件、自己的特长、兴趣、已有的实践创新成 一、申请理由 果等）
具有的 1 具有的创新课题研究必备知识条件
本小组由 1 名三年级学生和 2 名二年级学生组成。随着专业课程学习的增多， 使我对所学专业有了更直接、更深入的了解，并对其产生了浓厚兴趣。平日通过图 书馆、网络对各种相关资料的关注与思考，使我对此课题研究有了一些想法。加之 一直都很喜欢做实验并且动手能力较强、善于思考，更想通过和队友的合作对这一 课题进行更加深入、细致的研究，得出令人满意的研究成果。同时，在这一过程中， 通过对出现的各种问题的思考与探究，更能丰富我们的知识储备，拓展我们的眼界 与思路，这对我们今后的学习与进步是具有重大意义的。
1、项目意义及内容 项目意义及内容 意义及
本课题研究内容属于国家“863” “生物与医药生物技术”领域中“新一代工业 生物技术”专题的前沿探索类课题部分内容。L-精氨酸是人体和动物体内的半必需 氨基酸，也是生物体尿素循环的一种重要中间代谢物，在医药工业上具有广泛的用 途，钝齿棒杆菌 C. crenatum SYPA 是革兰氏阳性工业用菌株，在精氨酸的合成是由 谷氨酸开始的循环途径中 NAGK 是其合成途径的第二个酶 （如图 1） 催化乙酰谷氨酸 ， 磷酸化生成乙酰谷氨酸磷酸，NAGK 的催化反应受到精氨酸的反馈抑制和反馈阻遏， 是精氨酸合成途径的关键酶。 本课题利用分子生物学定点改造技术通过对 argB 基因序列中 L-Arginine 的结 合位点的氨基酸的部分改造而解除或降低其对 NAGK 的产物的反馈抑制作用。再将其 转化至高产精氨酸钝齿棒杆菌 C. crenatum SYPA 中，获得重组 C. crenatum 并对其 进行发酵精氨酸的生长及产酸研究。实验流程图如图 2 所示。
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构建重组质粒pJCtac-argB’ ’ 构建重组质粒 加强表达 钝齿棒杆菌 C. Crenatum NAGK 晶体结构 分析 定点改造 设计 结构比较分析
图 2 实验流程图
重叠 PCR
解除反馈抑制 NAGK’ ’ 晶体结构 分析
2、课题前期进展： 课题前期进展：
本课题在前期利用筛选出的具有自主知识产权的高产精氨酸钝齿棒杆菌 C.
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五、经费预算 材料费（引物设计及酶活测定所需试剂）:4000 测试费（DNA 测序及代谢产物的测定） ：3000 出版/文献/信息传播/知识产权事务费：3000 总计：10000
六、导师推荐意见 导师推荐意见 推荐 该项目对钝齿棒杆菌 L-精氨酸合成途径关键酶 NAGK 编码基因 argB 的进行定 点突变改造研究， 在研究了产物精氨酸对 N-乙酰谷氨酸激酶 NAGK 酶活的抑制作用 的基础上，通过选择产物精氨酸的的氨基酸结合位点进行定点改造，达到降低或消 除产物反馈抑制作用，并将其返回到钝齿棒杆菌中进行表达，进行发酵结果分析， 其中包括产酸能力分析及代谢流量的分析。从而达到提高 L-精氨酸产量的目的。选 题新颖，项目基础扎实，研究方案详实可行，团队组成合理。同意该研究团队的项 目立项，并推荐申报“江苏省高等学校大学生实践创新训练计划”项目。
crenatum SYPA5 为出发菌株，通过 NCBI 上公布的谷氨酸基因组核苷酸序列设计引物
获得了来自钝齿棒杆菌 C. crenatum SYPA5 精氨酸合成的关键酶 N-乙酰谷氨酸激酶 （NAGK）编码基因 argB， 对其进行了同源性分析，与谷氨酸棒杆菌的 argB 同源性 达 98.7%。并将其在大肠杆菌中进行表达并纯化，对重组 NAGK 进行了酶学性质的研 究，研究表明，当 L-Arginine 浓度只有 0.1mmolL 时，来自钝齿棒杆菌的 NAGK 酶 活明显受到抑制。因此解决产物抑制是提高循环途径产精氨酸中的重要环节。 发表文章及专利： 发表文章及专利： 1、Hong Xu, Wenfang Dou, Hongyu Xu, Xiaomei Zhang, Zhiming Rao, Zhongping Shi, Zhenghong Xu. A two-stage oxygen supply strategy for enhanced L-arginine production by Corynebacterium crenatum based on metabolic fluxes analysis. Biochemical Engineering Journal. 2009,43:41-51 2、刘飞,饶志明,徐美娟,许泓瑜,张晓梅,窦文芳,许正宏.钝齿棒杆菌乙酰谷氨 酸激酶编码基因 argB 的克隆表达、纯化及酶学性质研究.工业微生物，2009， 3、饶志明，许正宏，徐美娟，张晓梅，许泓瑜，窦文芳. 加强表达 N-乙酰谷氨 酸激酶的重组钝齿棒杆菌及该菌的应用，申请号：200810155133.0