第三章 第一节 血管壁的止血作用及检验
TM 操作
1.绘制校正曲线 人TM标准品用缓冲液A做倍比稀释，TM的浓度分别为 500，250，125，31.25，15.6，7.3,3.9和0ng/ml,以人TM浓度为横 坐标，以cpm为纵坐标绘制校正曲线。
2.将200μl的抗人TM单抗包被液加入聚苯乙烯放免小杯中，4℃过夜， 用洗涤液A洗3次，将待测样本（或标准品）0.25ml与等量缓冲液A 混合，每小杯加入20μl稀释样品液（空白管加入缓冲液A），37℃ 水浴2h，用洗涤液A洗3次，加入200μl125I-抗人TM单抗，37℃水 浴2h，再用洗涤液B洗六次，在γ闪烁测定仪上测定放射活性，在 校正曲线上查出相应的浓度。
vWF:Ag 操作
单抗以0.1mol/L的碳酸盐缓冲液（pH9.5）稀释成 10μg/ml加入反应板中，每孔0.2ml，置于湿盒中4℃ 过夜。
0.05%Tween—20，0.01mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4， Tween—PBS）洗3次后加入用0.4%BSA—PBS稀释的待 测血浆或培养液上清，每孔0.2ml，37℃温育2小时。
一、基本理论
血管壁的止血功能
激活血 小板
收缩 反应
激活凝 血过程
抗血 栓特 性
第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验
血小板的止血功能
血管损伤（抗血栓特性降低）
血管收缩
激
活凝血过程
血流减慢 纤维蛋白形成
血管内皮下成分暴露
血小板黏附、聚集、释放
血栓形成
第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验
二、血管壁（内皮）检验
血浆血管性血友病因子抗原vWF:Ag，ELISA法
原理纯化的兔抗人vWF:Ag抗体包被聚苯乙烯反应板，加入 稀释的待测血浆，样本中的vWF:Ag结合于固相的抗体 上，然后加入酶标记兔抗人vWF:Ag抗体，与其定量结 合，洗去多余抗体后，加底物显色，通过查找标准曲 线，即可计算出vWF:Ag的含量。
第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验
同前洗涤3次后，加入用同上缓冲液稀释的酶标vWF单 抗，每孔0.2ml，37℃温育2小时。
第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验
vWF:Ag 操作
同前洗涤5次后，每孔加底物溶液（OPD 1mg/ml，用 0.1ml/L，pH4.5的枸橼酸盐缓冲液配制，30%过氧化 氢0.5μg/ml）0.2ml，置室温约5分钟后，各孔加 3mol/L硫酸0.05ml终止反应。
第十三章 血栓与止血检验
编辑制作 熊石龙
一、基本理论
血管壁的结构
血管壁的正常结构包括三层：内层、中层和外层 内层：内皮细胞+基底膜
内皮细胞管壁有肝素类物质 内皮细胞内含细胞器 （棒状小体 vWF和t-PA，TM，AT-Ⅲ,PAI-1等 ） 中层：平滑肌细胞（脉细血管无此层） 外层：结缔组织
第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验
第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验
vWF:Ag 应用评价
血管性血友病因子抗原测定主要用于血管性血友病的诊断和鉴别诊断 1.减低 见于血管性血友病（vWD），是诊断vWD及其分型的重要依据 2.升高 见于血栓性疾病，如急性冠脉综合征（ASC）、心肌梗死、
脑血管病变、妊娠高血压综合征、肾小球疾病等，同时也见 于剧烈运动后，肾上腺素受体被兴奋等。 应用评价以前vWF：Ag定量常采用免疫火箭电泳，由于操作较为复杂，现 在少用。ELISA常用于定量检测vWF：Ag，但是胶乳增强的免疫比浊 法更为简便快速，而且可以在全自动血凝仪上进行测定。
TM 参考区间 25～52μg/L
第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验
TM 应用评价
TM是由血管内皮细胞合成和分泌释放的，它表达于血管内皮细胞 表面，和循环血液中的凝血酶形成1：1的TM-凝血酶复合物，此复合 物将蛋白C（PC）激活为活化蛋白C（APC），APC有灭活FⅧa、FⅤa和 激活纤溶活性的作用，因此TM对于血管的抗凝作用十分重要。正常情 况下，血浆中TM的含量很低，但当血管内皮受损后，血浆中的TM含量 明显升高且与内皮的损伤程度相关。目前认为，TM:Ag的检测是了解 血管内皮损伤最好的指标。
室温放置10min后在酶标仪上测定492nm处的吸光度值。 绘制标准曲线 正常混合血浆以0.4%BSA—PBA按1：
20、1：50、1：100、1：200、1：500、1：1000六种 浓度稀释，与待测样品在相同条件下测定。
第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验
vWF:Ag 参考区间
参考值： 61.6%～126.6% 注意事项 对血浆vWF：Ag浓度过高的标本，应稀释后再测定。 所有ELISA测定中应注意的事项均应引起重视。 除本方法外，也可以采用胶乳增强免疫比浊法。
TM:Ag的水平升高 见于血栓性疾病，如糖尿病、心肌梗死、脑血 栓、深静脉血栓形成（ DVT）、DIC等。
第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验
TM 注意事项
1.如果样品不能当天测定，应在采血后立即将血浆分离 出放于-20℃冷冻保存。冷冻的样品复溶时应在37℃ 水浴中进行，室温中缓慢解冻则可导致TM沉淀。
2. 若样本中的TM含量超过校正曲线范围应适量稀释后 再次测定。
第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验
血浆6-酮-前列腺素F1α检测
原理 ELISA法：将抗原（血浆6-酮-前列腺素F1α牛血清白蛋白连接物）包被于固相载体上，与游离抗 原（待测样品或6-酮-前列腺素F1α标准品）竞争性 地与一定量的抗6-酮-PGF1α抗体结合，洗涤后加入 过量的酶标记第二抗体，再加入底物显色。待检血浆 或标准品中的6-酮-PGF1α含量与显色程度呈负相关， 根据显色程度（A值）即可从标准曲线中推算出待检 血浆中6-酮-PGF1α的含量。
第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验
凝血酶调节蛋白，TM
原理将抗人凝血酶调节蛋白（Thrombomdulin,TM） 单克隆抗体包被于聚苯乙烯放免小杯中，样本中的TM 结合于包被的放免小杯上，加入125I-抗人TM单抗， 根据结合的125I放射性强度计算出样品中TM的含量。
第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验