农杆菌
Vir 帮助质粒
左 外源基 右 感染植物
进入植物细胞核， 整合，表达
Vir 左 外源基因 右
农杆菌
双元系统的特点
双元系统是穿梭质粒和Ti质粒两个质粒 ，在接合 后可以自主性地共存于同一农杆菌细胞中。
穿梭质粒编码植物选择标记、表达信号、多克隆 位点、两个T-DNA
④Ori区(origin of replication，复制起 始区)：Ori区上的基因调控Ti 质粒的自我 复制。
(2). 农杆菌的感染和生存
第一步:植物受伤 乙酰丁香酮、羟基乙酰丁香酮诱导Ti
质粒的毒性基因表达。 第二步 感染植物
脓杆菌吸附于植物的表面伤口部位 第三步 毒性基因（vir）表达 第四步 T-DNA转移
ori
(7) Ti载体的类型
共整合载体（cointegrate vectors） 由比利时科学家P.Zambrisky等1983年改造 的pGV3850 受体载体，需要同源重组才能插入外源基因。
双元载体（binary vectors） 既有大肠杆菌复制起点也有农杆菌复制起点， 是个穿梭载体。
①pGV3850
外源基因插入pGV3850 的过程
pBR322不能在土壤农杆菌中复制，只能同 pGV3850重组。只有这样，土壤农杆菌才能得 到抗卡那霉素性状。
外源基因 插入
Kanr pBR322
抗卡那霉素 卡那霉素筛选
转化
的土壤农杆菌 pBR322与 土壤农杆菌 感染 pGV3850重组 含pGV3850
植物组织
物的细胞中 筛选转化细胞，并诱导产生转基因植株 转基因植株大规模种植
三、外源基因导入植物的方法
（一）DNA直接转移法
化学刺激法
PEG、PNA（肽核酸）、磷酸钙、氯化钙
电击法
基因枪法
花粉通道法
将外源DNA片段在自花授粉后的特定时期注入 柱头或花柱，外源DNA沿花粉管通道或传递 组织通过珠心进入胚囊，转化不具备细胞壁 的受精卵，合子或早期胚体细胞。
基因。
（6）Ti 质粒的改造
除去T-DNA上的tmt，tms和tmr生物合成 基因；
除去 Ti 质粒的其它非必需序列， 安装大肠杆菌复制子，
安装植物细胞的筛选标记，如 neor 基因， 使用植物基因的启动子和polyA化信号序列；
插入人工多克隆位点，以利于外源基因的 克隆。
改造后的Ti质粒载体模式
特点：外源基因不能直接插入，需要借助 于pBR322质粒作为中间载体
选择标记
脓杆菌选择标记
宿主土壤农杆菌的选择标记是位于中间载 体pBR322上的卡那霉素抗性（Kanr）基 因。卡那霉素抗性（ Kanr ）基因（卡那 霉素对植物有剧毒！）
最终受体植物的选择标记
位于T-DNA右半部分的胭脂碱合成酶基因 （nos）。
单链T-DNA被切下来，整合到植物基因 组中。 第五步 诱导冠瘿瘤
T-DNA上的产物催化产生过量的生长素和细胞分裂素，形成植物冠瘿瘤。
(3).Ti质粒转化的对象
裸子植物、双子叶被子植物、禾谷类单子叶 植物（玉米）
(4). Ti质粒作为载体的可能性 能够自发地整合到植物的染色体上。
能转化多种植物。 强启动子
胭脂碱筛选
整合到
外源基因 表达鉴定
染色体上
转化后可诱导愈伤组织分化成转基因植物
共 整 合 转 化 程 序
②双元载体（binary vectors） 能在大肠杆菌和农杆菌中复制，是穿梭载体。 双元载体的结构
Ti质粒被剔除了T-DNA、冠瘿碱代谢基因、 vir基因。 大幅度减小质粒的体积。（<10kb）
在T-DNA 的两端还含有左右2 个边界，长为 25bp的末端重复顺序，在切除及整合过程具 有重要意义。
左边界
生长素 基因
细胞分裂 素基因
tms
tmr
冠瘿碱 合成
tmt
右边界
②毒性基因（vir）
决定土壤农杆菌对植物的感染和T-DNA的转 移， 进入和整合。使根癌农杆菌表现出毒性 。③Con 区(regions encoding conjugations，接合转移编码区)：该区 段上存在与细菌间接合转移的有关基因， 调控Ti 质粒在农杆菌之间的转移。
（1） Ti 质粒的图谱区 整个质粒160 -240 kb T-DNA区、 Vir区、 Con区、 Ori区
①转移DNA T-DNA（transfer-DNA） T-DNA 12 -24 kb
tms的编码：合成吲哚乙酸
tmr的编码：合成植物分裂素
tmt的编码：合成氨基酸衍生物冠瘿碱
Ti的精髓：Vir基因（转移）和左右界（整合）
双元载体的转化
基因插入
转化农杆菌之前，所有的克隆步骤都在大 肠杆菌里操作。
帮助质粒（ helper plasmid） 受体农杆菌内要求带有整套vir基因（但缺 失T-DNA及左右边界）的“帮助质粒”提 供vir产物。
E.coli
左 外源基因 右 双元载体 转化
（二）载体介导法
Ti 质粒介导的整合转化程序 植物病毒介导的转染程序（略）
1 Ti 质粒介导的整合转化程序
Ti 质粒的结构与功能
双子叶植物尤其豆科植物的根部常常会由于植物根部 被土壤杆菌农杆根瘤菌（A.tumefaciens）形成根瘤 ，其致瘤特性是由该菌细胞内的野生型质粒 Ti质粒（ Tumor-inducing plasmid）介导的，又称肿瘤诱导 质粒。
第八章 植物基因工程
转基因植物 将外源基因导入植物细胞，经组织培养， 获得能够表达外源基因的植物称为转基因 植物。 抗虫 抗病 抗逆 生产药物
第一节 植物的转基因技术
植物细胞培养技术 植物转基因技术的基本路线 转基因的受体系统 外源基因导入植物的方法
一、植物转基因技术的基本路线
分离目的基因 将目的基因与载体连接，形成重组DNA 利用细菌繁殖扩增重组DNA 将与表达载体相连的重组DNA导入到目标植
T-DNA的opine合成酶基因上有一个强 启动子，能启动外源基因的表达。
(5) 天然Ti质粒作载体的缺点
野生型Ti 分子大（200kb）操作起来十分麻烦； 各种限制型酶切位点多，切割产生很大片段。且单
一的酶切位点很少； tms和tmr 基因产物干扰植物内源激素的平衡，产
生冠瘿瘤，阻碍转基因植物细胞的分化和再生； 无大肠杆菌的复制起点和作为转化载体的选择标记