③插入时应注意方向，不要倒插。茎段、茎尖 基部插入培养基利于吸收水分和养分
思考：你打算做几组重复？你打算设置对照实 验吗？
答：每种材料或配方至少要做一组以上的重复。 设置对照实验可以取用一个经过灭菌的装有培养 基的锥形瓶，与接种操作后的锥形瓶一同培养， 用以说明培养基制作合格，没有被杂菌污染。
（四）培养
愈伤组织:细胞排列疏松而无规则,是高度液泡 化的、成无定形状态的薄壁细胞。
人参的愈伤组织
菠萝的愈伤组织
1、影响植物组织培养的因素 （1）植物材料的选择
烟草和胡萝卜的组织培养较为容易
枸杞愈伤组织的芽诱导比较难 同一植物材料的年龄、保存时间的长短会 影响实验结果
菊花的组织培养一般选择未开花植株的茎 上部新萌生的侧枝
使用顺序
先使用生长素，后使用 细胞分裂素
先使用细胞分裂素后使 用生长素
同时使用
实验结果 有利于细胞分裂，但不 利分化 细胞既分裂也分化
分化频率高
③生长素和细胞分裂素同时使用，用量的比例 对植物细胞发育方向的影响 生长素 > 细胞分裂素： 有利于根的分化 生长素 < 细胞分裂素： 有利于芽的分化，抑
2、配置培养基
① 配制培养液
② 调PH ③培养基的分装 分装到锥形瓶中，每瓶分装50ml或100ml 由于菊花的茎段的组织培养比较容易，因此 不必添加植物激素
3、灭菌 分装好的培养基连同其他器械一起进行高压蒸 汽灭菌
（二）外植体消毒
1、选材：菊花茎段，取生长旺盛的嫩枝 2、消毒
①流水冲洗
菊花茎段用流水冲洗后可少许洗衣粉，用软刷 轻轻刷洗，刷洗后在流水下冲洗20min左右
必要条件： 一定的营养物质、激素和其他 外界条件
原理: 细胞的全能性
相关概念: 外植体
从活植物体上切下进行培养的那部分细胞、 组织或器官
植物组织培 养流程图
脱分化：由高度分化的植物组织或细胞产生愈伤组
织的过程，称为植物细胞的脱分化，或去 分化。
再分化： 脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又
可以重新分化成根或者芽等器官，这个过 程叫做再分化。
专题3 植物组织培养技术
课题1 菊花的组织培养
课题1： 菊花的组织培养
一、原理：细胞的全能性
①定义：已经分化的细胞，仍然具有发育成完整 个体的潜能。
②原理：生物体的每一个细胞都包含有该物种所 特有的全套遗传物质，都有发育成为完 整个体所必需的全部基因。
③全能性的比较: 受精卵>生殖细胞>体细胞
二、植物组织培养 细胞离体
2、无菌操作要求
操作要在酒精灯火焰旁完成，每次使用器械后， 都需要用火焰灼烧灭菌，接种后立即盖好瓶盖。
3、材料的切取和接种
4、接种注意事项
①每接种一块外植体前，镊子需放入体积分 数为75％的酒精溶液中消毒一次，然后在酒 精灯火焰上烧一遍，冷却后再接种
②外植体在培养基中要分ຫໍສະໝຸດ 均匀，放置外植体 数量根据锥形瓶的大小确定，一般胡萝卜3－ 4块，菊的茎或叶6－8块，也不要太少，以充 分利用培养基中的营养成分和光照条件
（2）培养基的配置
MS培养基主要成分包括： 大量元素: N、P、 S 、 K、Ca、Mg等
微量元素:B、Mn、Cu、Zn、Fe、Mo、I、 Co等
有机物、植物激素
讨论：你能说出各种营养物质的作用吗？同专题 2中微生物培养基的配方相比，MS培养基的配方 有哪些明显的不同？
答：微量元素和大量元素提供植物细胞生活所必 需的无机盐；蔗糖提供碳源，同时能够维持细胞 的渗透压；甘氨酸、维生素等物质主要是为了满 足离体植物细胞在正常代谢途径受到一定影响后 所产生的特殊营养需求。微生物培养基以有机营 养为主。与微生物的培养不同，MS培养基则需 提供大量无机营养，无机盐混合物包括植物生长 必须的大量元素和微量元素两大类。
制根的分化 生长素、细胞分裂素适中：促进愈伤组织生长
（4）pH、温度、光照
pH控制在5.8左右，温度控制在18－22。C,每 日用日光灯照射12h
3、植物组织培养过程:
植物细胞培养
细胞分裂
离
素>生长素
体 组
脱分化
愈 伤 再分化
芽
织 或 细
细胞分 裂素≈
组 织
根 细胞分裂
植 物 体
胞 生长素
素<生长素
4、植物组织培养的应用：
1、培育无病毒植株
2、 培养紫草愈伤组织,提取紫草素（治疗烫伤 和割伤的药物以及染料和化妆品的原料）
3、诱导离体的植物组织形成具有生根发芽能力 的胚状体结构，包裹上人造种皮，制成人工种 子，可以解决有些作物品种繁殖能力差，结子 困难或发芽率低等问题
4、基因工程中亦需用到植物组织培养的方法
② 酒精处理
用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入体 积分数为70％的酒精中摇动2－3次，持续6－ 7s，立即将外植体取出，在无菌水中清洗
③消毒液处理
取出后用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分， 放入质量分数为0.1％的氯化汞溶液中1－2min， 取出后在无菌水中至少清洗3次，漂净消毒液
（三）接种
1、接种室消毒 污染的主要来源是空气中的细菌和孢子，接种 室消毒是至关重要的。用70％的酒精喷雾使空 气消毒， 酒精或新洁尔灭搽洗工作台并用紫外 线照射20分钟
人工种子
二、实验操作 （一）制备MS固体培养基
MS培养基包括20多种营养成分，实验室一般 使用4。C保存配制好的培养基母液来制备
1、配置各种母液
①无机物中大量元素浓缩10倍，微量元素浓 缩100倍，常温保存
②激素类、维生素类以及用量较小的有机物一 般可按1mg/ml的质量浓度单独配制成母液
③用母液配制培养基时，需要根据各种母液 的浓缩倍数，计算用量
（3）植物激素的影响
①常用的植物激素：生长素、细胞分裂素和 赤霉素 生长素类：（2，4－D）、（IAA）、（NAA）、
（IBA）
细胞分裂素类： 激动素（KT）、6－苄基嘌呤 （ 6－BA）、玉米素（ZT）
赤霉素类： 赤霉酸（GA3）
②生长素和细胞分裂素作用
植物中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、 脱分化和再分化的关键性激素。在生长素存在 的情况下，细胞分裂素的作用呈现加强的趋势
1、愈伤组织的培养
从接种外植体到出现愈伤组织需经过2周时间。2 周之内可以看到外植体上逐渐长出乳白色或黄白 色的瘤状愈伤组织。首次培养愈伤组织时，恒温 箱的门应该关闭不必见光，因为在无光条件下愈 伤组织长的更快。2周后，培养基成分接近耗尽， 必须更换培养基，进行继代培养