实验十一 PEG诱导细胞融合一、实验目的1．了解聚乙二醇诱导细胞融合的原理与技术。

2．学会鉴别融合细胞。

二、实验原理细胞融合又称细胞杂交，是指两个或两个以上的细胞合并成一个细胞的现象。

细胞融合技术是细胞工程骨干技术，除了用于一些基础性研究外，在植物方面主要用于合成新种；动物方面主要用于生产单克隆抗体。

细胞融合的诱导因素主要有以下三种：1、生物融合因子：如病毒。

2、物理因素：如电融合仪,主要用于植物细胞。

3、化学因素：如聚乙二醇（PEG），分子量200－6000都可用，以1000较好。

聚乙二醇最早用于诱导植物原生质体的融合，现已普遍用于多种细胞。

其优点是:材料易得、操作方法简单、效果稳定。

病毒介导的细胞融合常用灭活的仙台病毒，主要用于动物细胞融合。

其优点是融合率高，对各种动物细胞都适宜；缺点是不稳定，在保存过程中融合活性降低，并且制备过程繁琐。

细胞融合，即在自然条件下或利用人工法 (生物的、物理的、化学的)，使两个或两个以上的细胞合并成一个具有双核或多核细胞的过程。

人工诱导细胞融合始于20世纪50年代，并迅速成为一门新兴技术。

由于不仅同种细胞可以融合，种间远缘细胞也能融合，甚至于动植细胞也能合二为一，因此细胞融合技术目前较广泛应用于细胞生物学、遗传学和医学研究等各个领域，并且取得显著的成绩。

聚乙二醇(PEG)结构为：HOH2C(CH20CH2)nCH2OH，相对分子质量在200-6000均可用作细胞融合剂。

普遍认为聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，从而使细胞发生融合：细胞融合率是指在显微镜的一个视野内，已发生融合的细胞核总数与该视野内所有细胞(包括已融合的细胞)的细胞核总数之比，通常以百分比表示。

该方法的优点是：用法简单，容易获得融合体，融合效果好。

三、实验材料及用品实验材料：鸡红细胞、鸡白细胞实验器材：普通离心机，水浴锅：50ºC，37ºC，细胞计数板四、实验步骤1、配50％PEG：称取10gPEG，加入带盖离心管中；将带盖离心管放入电炉上的沸水中，加热使PEG熔化；待冷却至50ºC时，加入等体积预热至50ºC的HanKs液或不加血清的培养液混匀，保存于37ºC水浴中。

2、准备鸡血：加2ml肝素抗凝鸡血于10ml带盖离心管中，800rpm离心5min，去血浆；再加5ml Hanks液洗红细胞一次，800rpm离心，去上清；配制成2%鸡血。

3、分离鸡白细胞：1ml淋巴细胞分离液+1ml鸡血，2000rpm离心20分钟，吸出白细胞放入另一个离心管中加入5ml Hanks液1000rpm离心5min,弃上清。

4、混合细胞：取0.5ml鸡红细胞加入白细胞沉淀，用手轻弹离心管底部，使沉淀松散。

5、PEG介导融合：吸取1ml 50％PEG，在37ºC水浴中1分钟内加入细胞沉淀中，边加边振摇离心管，使PEG与细胞混匀；6、终止PEG作用：向试管中加入8－10ml Hanks液轻轻吹打混匀，在37ºC水浴中静置5min（稀释PEG终止其作用，并降低介质密度，便于离心）；7、离心除PEG：1500rpm离心5min，去上清；8、加培养液培养：加入1640完全培养液37ºC水浴培养30min。

9、观察：分别温浴10、20、30分钟取细胞悬液临时制片观察，直到观察到细胞融合为止（可用0.2%次甲基蓝染色）。

五、实验结果：六、实验注意事项：1. 由于离心时白细胞的数量很少，吸取的时候要小心，尽量把吸附在管壁上的白细胞都吸出来。

此外吸取的动作不能太大，否则会破坏离心形成的分层。

2. PEG处理时间不宜过长，最多不能超过90s，否则会有多个细胞彼此融合形成巨大的合胞体，或者细胞膜破裂导致细胞质外泄。

3. 经PEG处理后加液混匀时应轻轻洗打，以免刚刚融合的细胞分开。

4. 加PEG应该在37ºC水浴加，这样可以防止PEG凝固，导致离心失败。

5. 注意每次离心的时间和速度，否则得不到想要的白细胞。

七、实验拓展：细胞融合技术的发展及应用细胞工程是生物工程主要组成之一,出现于20 世纪70 年代末至80 年代初, 是在细胞水平上改变细胞的遗传特性或通过大规模细胞培养以获得人们所需物质的技术过程。

细胞融合技术作为细胞工程的核心基础技术之一,已在农业、医药、环保等领域取得了开创性的研究成果,而且应用领域不断扩大。

细胞融合技术不仅为核质关系、基因调控、遗传互补、细胞免疫学、肿瘤发生、基因定位、衰老控制等理论领域的研究提供了有力的手段, 而且被广泛应用于免疫学、遗传学、发生生物学, 特别是在单克隆抗体及动植物远缘杂交育种等方面具有十分重要的意义。

随着细胞融合技术研究的不断深入, 细胞融合技术的发展前景及其产生的影响将日益显著。

本文就其发展历史及研究进展, 主要应用及发展前景做一简要回顾及展望。

一、细胞融合及其意义（1）细胞融合的概念所谓细胞融合就是指在外力(诱导剂或促融剂) 作用下,两个或两个以上的异源(种、属间)细胞或原生质体相互接触,从而发生膜融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞的现象称为细胞融合( cell fusion) 或细胞杂交( cell hybridization) 。

如取材为体细胞则称体细胞杂交( somatic hybridization)。

体细胞融合后可形成四倍体或多倍体细胞, 由此形成的杂交细胞,其特性会有很大的变化。

（2）细胞融合的意义细胞能不受种属的局限可实现种间生物体细胞的融合,使远缘杂交成为可能,因而是改造细胞遗传物质的有力手段。

它的意义在于从此打破了仅仅依赖有性杂交重组基因创造新种的界限, 扩大了遗传物质的重组范围。

但融合后获得的杂种细胞具有染色体异倍性,致使细胞株的遗传性不稳定、植株不育性、畸形、生育迟缓等不符合育种要求的性状出现, 直接利用杂种细胞作育种材料目前还有许多障碍。

细胞融合技术避免了分离、提纯、剪切、拼接等基因操作,在技术和仪器设备上的要求不像基因工程那样复杂,投资少, 有利于广泛开展研究和推广, 有着重大的实践意义[1] ,正得到科学界的日益重视。

二、细胞融合技术发展的历史回顾人们很早就注意到了在自然条件下发生的细胞融合现象,首先在病料组织中发现了由细胞融合产生的多核细胞,紧接着发现在脊椎动物和无脊椎动物的正常细胞中也可发生细胞融合。

随后在体外组织培养中也发现了离体细胞的融合现象。

自从发现活病毒可在体内介导癌细胞融合后, 人们又实现了灭活病毒促进动物异种细胞的融合, 从而打破了细胞融合的种属屏障,推动细胞融合技术跃上新的台阶。

原生质体的大量制备技术限制了植物细胞融合技术的发展,因此植物细胞融合的起步比动物细胞融合要迟十年左右。

直到用酶法大量制备有活力的原生质体获得成功后, 才使植物原生质体的融合工作迅速发展起来。

然而, 由于病毒诱导细胞融合存在着病毒制备困难、操作复杂、灭活病毒的效价差异大等原因,人们又找到了比病毒简便、快速和高效且比病毒更易制备和控制、活性稳定、使用方便的化学物质PEG, 作为病毒的替代物诱导细胞融合,这是一个里程碑式的发现,引起实验生物学的“无声革命”。

但在PEG 诱导细胞融合的有效浓度范围内( 50 % ～55 % ) 对细胞毒性很大,因此人们又找到了新的方法来替代PEG 介导细胞融合法,这些新方法有电脉冲诱导细胞融合技术和激光融合技术等。

总之, 细胞融合技术在实践中不断发展和完善, 细胞融合方法得到了不断的更新和改进,融合率也得到逐步的提高。

现在新的细胞融合方法正在尝试将各种物不断提高的方向发展。

理、化学手段综合应用,使细胞融合的方法和手段操作更为简便，便于量化研究。

同时又能使融合率得到。

（1）自然发生的细胞融合早在19 世纪,人们就发现在自然条件下生物界中有“自发”的细胞融合现象。

Muller ( 1838 年) 在肿瘤中观察到了多核细胞,此后在由病毒感染的病料组织中如天花脓疱的周围、受水痘损害的皮肤、在麻疹病人的扁桃体中陆续发现多核细胞,这些多核细胞可能是病毒作用的结果：但当时还没有人认识到这一点。

1875 年Lange 首先观察到脊椎动物(蛙类)血液细胞合并，继之又有一些研究者在无脊椎动物中也发现了融合细胞。

（2）组织培养中发生的细胞融合自从Harrison (1907 年) 进行组织培养以后, 人们便开始注意组织培养中多核细胞的形成。

第一个报告组织培养中细胞合并的是Lambert ( 1912 年) 。

到了1960 年,法国Barski 首先实现了异种动物体细胞的融合。

但细胞在体外培养时, 自发融合的频率是极低的。

（3）病毒介导的癌细胞融合1958-1960 年日本学者冈田善雄(Okada)首先观察到流感病毒可杀死患欧利希癌的小白鼠腹腔中的腹水癌细胞( ETC) , 随后的研究中发现在取出的腹水中有无数巨大球形细胞。

进一步在电镜下观察发现巨大细胞是呈车轮状排列的几个以至几十个核的多核细胞。

这种多核细胞是由ETC 融合形成的, 并且发现这种巨大细胞形成的频率与接种病毒的量成一定比例。

此后一系列的试验表明病毒能引起细胞融合的现象。

此后, 冈田善雄又发现流感病毒HVJ 株在体外也可促进ETC 的融合反应。

添加病毒后发现ETC 立即凝集,在37 ℃下5 min 后细胞开始相互融合。

他又对影响细胞融合现象的因子,如温度、氧气、钙离子、pH 值等对细胞融合的影响进行了比较深入的探讨，做了大量开创性工作,这些发现使得病毒类成为研究的最早的促融剂，并在此基础上开展了一系列的改进研究工作。

（4）灭活病毒诱导的异种动物细胞融合一些致癌病毒虽然能够诱导细胞融合, 但由于具有毒性大等潜在的危险性而在应用上受到很大的限制,由此科研人员又试图尝试使用灭活的病毒来作为促融物, 并且以异种细胞作为融合对象。

1965 年,英国Harris等报告灭活病毒可以用来融合不同种动物的细胞,并且指出由此产生的杂交细胞可以存活。

当时世界上许多报刊很快就对这一发现在生物学上的重要性做出了评价, 认为这是在细胞融合研究中的又一次突破。

他们的贡献在于证明了灭活的病毒可以作为一般方法用来在定的条下融合一件动物细胞,而且差异很大的动物种之间的细胞可以被诱导融合, 融合的细胞可以存活。

同时Littlefield ( 1964 年)又设计出有效筛选杂种细胞的一系列方法,从而进一步推动了融合细胞的实验工作。

1967 年Weise和Green发现在人和鼠的融合细胞中,人的染色体优先丢失,并证明利用这一特点有可能对人染色体上的基因进行定位。

同年Watkins 和Koprowski等又分别证明融合细胞能使缺陷型病毒复原。