2.7.1 分 配 层 析
分离的先决条件：各种AA成分的分配系数有差异，差异越大，越容易分开。 而且其在流动相中分配系数越大其分离的越快。
（1） 纸层析
以滤纸为支持物的分配层 析。组成滤纸的纤维素是 亲水物质，能形成水相和 展层溶剂的两相系统，被 分离物质在两相中的分配 保持平衡关系。
比移值（Rf）:
多肽序列自动分 析仪的工作原理 基于此反应。
(4)形成西佛碱反应
氨基酸的α-氨基能与醛类化合物反应生成弱碱，即所谓西佛碱 （Schiff’s base）。 R’ | C=O + | H 醛 R | -H2O H2N-C-COOH------------→ | H 氨基酸 R’ R | | C=N-C-COOH | | H H 西佛碱
H N C S + H2N C R
H
+
COOH
在弱碱中
PITC H HO
N S C N H C O H C R
N S C N H
C
O H C R
PTC-氨基酸
PTH-氨基酸
氨基酸与异硫氰酸苯酯的反应的应用 －－多肽链N-末端氨基酸残基的鉴定（Edman法）
蛋白质多肽链的N-端氨基酸先在弱碱条件下也可以与PITC 起反应生成PTC－蛋白质，再在酸性溶液中，末端的PTH氨基 酸被释放，形成了少一个氨基酸的多肽链。 PTH氨基酸可以用 乙酸乙酯抽提，用纸层析进行鉴定，确定肽链N-端氨基酸。重 复应用这种方法就可以测出多肽链N-端的氨基酸顺序。
水合茚三酮
用途：常用于氨基酸的定 性或定量检测。
α-氨基和α-羧基共同参加的反应
脯氨酸和羟脯氨酸与茚 三酮反应产生黄色物质
2.7 氨基酸混合物的分析分离
• 要测定蛋白质的氨基酸组成或从蛋白质 水解液中制取氨基酸，须对氨基酸进行 分析分离。 • 常用层析法：也成为色谱法。 • 由流动相和固定相组成
分类
• 2.7.4、高效液相色谱
• 高 效 液 相 层 析 (high performance liquid chromatography，简称HPLC) • 曾 称 高 压 液 相 层 析 (high pressure liquid chromatography)。特点是： • ①使用的固定相支持剂颗粒很细，因而表面积 很大；② 溶剂系统采取高压，因此洗脱速度增 大。 • 多种类型 的柱层析都可用 HPLC 来代替，例如 分配层析、离子交换层析、吸附层析以及凝胶 过滤。
• 2.6 氨基酸的化学反应
－氨基参加的反应
氨基酸的化学反应
－羧基参加的反应
侧链功能基团参加的反应
2.6.1 α-氨基参加的反应
(1) 与亚硝酸反应
测量氮气的体积可计算氨基酸的含量。
NH2 R C H COOH OH
+
HNO2
R
C H
COOH
+ H2O
+ N2
这是Van Slyke（范斯来克 ）法测定氨基酸的基础。
层析分类
分类原则 据溶质分子与固定 相相互作用的机理 不同 类型 吸附色谱 离子交换色谱 疏水作用层 金属螯合色谱 共价作用色谱 分配色谱 凝胶过滤 亲和色谱 低压色谱 中压色谱 高压色谱 电泳 柱色谱 纸色谱 薄层色谱 气相色谱 液相色谱 超临界流体色谱 迎头法 顶替法 洗脱法 特征 吸附力不同 各物质与固定相之间的离子交换能力的不同 各物质与固定相之间的疏水作用的强弱不同 各物质与固定相上的金属离子的络合能力的不同 巯基化合物的巯基与固定相表面的二硫键作用力不同 各物质在两液相间的分配系数不同 各物质的分子大小或形状不同 利用生物大分子与各种配基的生物识别能力不同 操作压力小于0.5 MPa 操作压力在0.5～5 MPa之间 操作压力在5～40 MPa之间 溶质分子在电场中的移动速度不同 固定相装在玻璃、不锈钢或有机玻璃柱中 固定相为以氢键与纤维素羟基结合的水 固定相在玻璃平板上铺成薄层 流动相为气体 流动相为液态 流动相为液态
西佛碱是以氨基酸为底物的某些酶促反应例如转氨基反应的 中间物。（通常希夫碱是由胺和活性羰基缩合而成。具有优良液 晶特性，医药，催化等应用。 ）
(5)脱氨基反应
脱氨基作用是指 α- 氨基能在酶的催化下脱去氨基生成α-酮酸的 过程。这是氨基酸在体内分解的主要方式。
（6）与 甲 醛 的 反 应
氨基酸的甲醛滴定法
一级胺
氨基酸在脱羧酶的参与下脱去羧基产生生物胺以及 CO2。由氨基酸脱羧生成的胺类在动物体内有许多是 在生理上、药理上起重要作用的，在细菌中有着中 和酸性培养基的作用。一般说其中有许多是有毒的 物质
2.6.3 α-氨基和α-羧基共同参加的反应
与茚三酮的反应
α-氨基酸与水合茚三酮试剂共 热，可发生反应生成紫化合物。 反应生成的化合物的颜色深浅 程度以及CO2生成量，均可作为 氨基酸定量分析依据。
1945年由Sanger 发明此法
Ala
曾用此方法测定了胰岛素的 N -末端。
与异硫氰酸苯酯的反应（Edman反应）
在弱碱条件下，氨基酸中的α－氨基和可以与 异硫氰酸苯酯（PITC，Edman（埃德曼）试剂） 反应，生成苯胺基硫甲酰氨基酸（PTC-氨基酸）， 之后在酸性水解成苯基乙内酰硫脲衍生物（PTH氨基酸)
据实验技术
据固定相的形状不 同
据流动相的物态不 同 按操作方式不同
将混合物溶液连续通过固定相，只有化学亲和力最弱的组分以纯粹状态最先流 出，但其它各组分都不能达到分离。 利用一种化学亲和力比各被结合组分都强的物质来洗脱，这种物质称为顶替剂。 此法处理量大，且各组分分层清楚，但层与层相连，故不能将组分分离完全。 将混合液尽量浓缩，使体积缩小，引入固定相的一端，然后用溶剂洗脱，洗脱 溶剂可以是原来溶解混合物的溶剂，也可选用另外的溶剂。
氨基酸虽然是两性电解质，既是 酸又是碱，但却不能直接用酸碱滴定 来进行定量。这是因为氨基酸的酸碱 滴定的滴定终点PH值或过高或过低 没有适当的指示剂可供选用。然而向 氨基酸例如甘氨酸溶液中加入过量的 甲醛，用标准氢氧化钠滴定时，由于 甲醛与氨基酸中的－NH3作用形成羟 甲基和二羟甲基氨基酸等羟甲基衍生 物,促使氨基酸分子上的－NH3+基解 离释放出H＋，从而降低了氨基的碱 性，使溶液的酸性增强，使pKa2减少 了2－3个PH单位， pKa2移至7附近。 氢氧化钠滴定曲线B段向低PH值的方 向转移（变成曲线C段），
• 分离氨基酸混合物经常使用强酸型阳离子（阳 离子交换树脂）交换树脂。
• 氨基酸在树脂上的牢固程度，主要取决于他们 之间的静电吸引，其次是氨基酸侧链与树脂基 质聚苯乙烯之间的疏水作用。 • 在pH 3左右，氨基酸与阳离子交换树脂之间的 静电吸引力的大小次序是： • 碱性氨基酸（A2+）＞中性氨基酸(A+)＞酸性氨 基酸（A-）。 • 洗脱氨基酸的有效方法是： • 逐步提高洗脱剂的pH和盐浓度（离子强度）。
8.0~9.6
用途： 用于测定氨基酸含量，也常用 来测定蛋白质水解程度。
2.6.2 α-羧基参加的反应
（1）成盐和成酯反应
NH2 R C H COOH + C2H5OH 干燥，HCl 回流 R NH2 C H COOC2H5+ H2O
氨基酸乙酯的盐酸盐
在特定的化学反应中保护羧基，活化氨基。 氨基酸酯是制备氨基酸的酰胺或酰肼的中间物
与2，4－二硝基氟苯的反应 （sanger反应）
在弱碱性溶液中，氨基酸的α－氨基容易与2，4－二硝基 氟苯的反应（DNFB）作用，生成稳定的黄色2，4－二硝基苯 氨基酸（简写DNP－氨基酸）。
O2N NO2
H N NO2
DNP-氨基酸（黄色）
F + H2N
H C R
COOH
在弱碱中
O2N
H C R
(2)与酰化试剂反应
O C H2 O C Cl + H2N COONa CH R 苄氧酰氯 在弱碱中 （后酸化）
O C H2 O C N H
COONa CH R + Na+ + Cl-
苄氧酰氨基酸
这些酰化试剂在多肽和蛋白质的人工合成中被用 作氨基的保护试剂。
(3)烃基化反应:（sanger反应+Edman反应）
P151
固定相：吸附水 流动相：水饱和丁醇：醋酸 =4:1 分配系数 ★在流动相中分配系数越大，移动 越快。 ★基本步骤： 点样、展层、现色、定性（定量）
纸层析小实验动画演示
• （2）薄层层析 • 将支持剂（硅胶、纤维素粉等）涂布在 玻璃板上制成均匀的薄层。 • 分辨率高，所需样品极微，层析速度快。
• 2.7.3、高效气相色谱
• 层析系统固定相为涂渍在固体颗粒表面的液体，的流 动相为气体如氢，氦、氮，称为气液层析或气液色谱 (gas—liquid chromatography) ，简称气相层析或气相 色谱。 • 待分析的样品被气化，气化了的样品将在流动的气相 和固定的液体之间发生分配而被分离。被分开的组分 和载气直接进入检测器。 • 气相层析法具有微量快速的优点，限制是要求样品能 气化和热稳定性高。
（3）柱层析
固定相：硅胶、纤维素、淀粉 支持剂吸附的一层不会流动的 结合水（吸附水） 流动相：沿固定相流过的与它 不互溶的的溶剂（苯酚、正丁 醇等） 分配系数 ★在流动相中分配系数越大， 移动越快。
P151
2.7.2 离子交换层析
• 离子交换树脂是具有酸性或碱性基团的人工合 成聚苯乙烯—苯二乙烯 (polystyrenedivinylbenzene)等不溶性高分子 化合物。聚苯乙烯—苯二乙烯是离子交换树脂 的基质(matrix)。 • 阳离子交换树脂，如—SO3H（强酸型）或— COOH（弱酸型），可解离出H+，对于在酸性 环境中的氨基酸阳离子，它们可以和H+发生交 换而“结合”在树脂上。 • 同样的阴离子交换树脂含有的碱性基团如— N(CH3)3OH（强碱型）或）—NH3OH（弱碱 型）可解离出OH-,能与溶液里的阴离子交换而 结合在树脂上。