花椒体内外抗肿瘤作用及其机制的初步研究(一)
作者：袁太宁,王艳林,汪鋆植
【摘要】目的研究花椒挥发油体内外抗小鼠H22肝癌细胞作用及其免疫学机制。
方法花椒挥发油按不同时间（24，48，72h）及不同浓度（0.5～8mg/ml）分别处理H22细胞，MTS 法分析细胞的增殖速度，用流式细胞仪测定细胞凋亡及细胞周期。
建立H22荷瘤小鼠模型，观察小鼠肿瘤的生长情况,计算肿瘤生长抑制率；ELISA法检测花椒挥发油处理后小鼠血清中IL-2和IL-12的活性。
结果4mg/ml花椒挥发油处理H22细胞72h可显著地抑制H22细胞增殖，1mg/ml花椒挥发油处理H22细胞72h即可导致亚凋亡峰的出现，且G0/G1期细胞增多,S 期和G2/M期细胞减少，花椒挥发油对小鼠实体瘤生长具有显著抑制作用，但不能提高荷瘤小鼠血清中IL-2和IL-12的水平。
结论花椒挥发油可抑制H22细胞增殖并激发细胞凋亡，但不能通过提高机体的免疫功能发挥抗肿瘤作用。
【关键词】花椒；H22细胞；凋亡；免疫功能
Abstract：ObjectiveTostudytheanti-tumereffectanditsimmunologicalmechanismoftheessentialoilofzanthoxy luminvivoandinvitro.MethodsTreatingH22cellsatdifferenttimeandwithdifferentconcentrationofthe essentialoilofzanthoxylum,MTSwasusedtoassaythecellproliferation,flowcytometrywasusedtoassa ythecellapoptosisandcellcycles.TheH22BALB/Cxenografttumormodeswereestablished.Theanti-tu moreffectofzanthoxylumwasobservedandtumorgrowthinhibitoryrate(IR)wascalculated.Theconten tofserumIL-2andIL-12wereexaminedbyELISAassay.ResultsTreatingH22cells72hby4mg/mlessential oilofzanthoxylumresultedinremarkableinhibitionofthecellproliferation.TreatingH22cells72hby1mg /mlessentialoilofzanthoxylumresultedinappearanceofsub-G1andincreaseG0/G1phasecellsanddec reaseSphaseandG2/Mphasecells.Theessentialoilofzanthoxyluminhibitedthegrowthoftumorintum or-bearingmice.However,essentialoilofzanthoxylumcouldnotincreasethecontentsofmurineserumI L-2andIL-12.ConclusionTheessentialoilofzanthoxyluminhibitsproliferationandinducescellapoptosis ofH22cells,butitcannotexerttheanti-tumorefficiencythroughreinforcingtheimmunefunction. Keywords：Zanthoxylum;H22cells;Apoptosis;Immunefunction
花椒属一种温热类中草药，辛,热,有小毒，归脾、肾两经,功能温中止痛,解毒杀虫，常用于治疗脾胃虚寒症。
花椒还是深受民众喜爱的重要食用性香料，其资源在我国分布很广,安全性高。
国内外研究报道花椒对消炎、镇痛、杀菌、抗病毒、抗寄生虫、抗真菌、抗氧化等均具有较强的作用〔1～5〕。
随着对花椒提纯和药理作用的深入研究,发现花椒还具有抗肿瘤作用,但目前对花椒抗肿瘤的研究还不够深入,其体内的抗肿瘤作用研究则更少。
为了认识花椒在体内外抗肿瘤作用的机制和特点,我们选用小鼠H22肝癌细胞为研究对象,观察了花椒在体内外对该细胞的作用，以期探讨花椒在体内外抗肿瘤作用及其可能的机制。
1材料
成熟花椒,采于湖北宜都，经汪鋆植博士鉴定为Zanthoxylumbungeanum。
H22腹水型小鼠肝癌细胞由本院保存，清洁级BALB/C小鼠由同济医科大学动物中心提供。
MTS细胞增殖分析试剂由Promega公司提供。
EPLCSXL流式细胞分析仪为BecmanCoulter公司产品,全波长酶标仪为为Thermo公司产品，R206D旋转蒸发器为上海申生科技有限公司产品。
2方法
2.1花椒挥发油制备使用旋转蒸发器提取花椒果皮挥发油并过滤除菌，称取适量挥发油加入5%Tween-80溶解的水溶液中，超声破碎仪处理10min，用RMPI1640无血清培养基或生理盐水稀释成所需要的浓度。
2.2细胞增殖分析将对数生长期的H22细胞以4×107/L细胞数接种于圆底96孔培养板,每孔50μl。
37℃培养24h后,向孔内直接加入含不同浓度（8，4，2，1，0.5mg/ml）花椒挥发油
的RPMI1640培养基50μl。
在加入药物后选定的时间点(24，48，72h),向每孔中加入20μlMTS 试剂,37℃继续保温2h显色,于490nm波长下读取OD值。
细胞生存率（％）=OD药物/OD对照×100％；
细胞生长抑制率（％）=(1-细胞生存率)×100%
2.3流式细胞仪测定细胞凋亡及细胞周期取1×106对照细胞或经不同浓度（8，4，2，1，0.5mg/ml）花椒挥发油处理的细胞,用冰冷PBS洗涤1次后,再悬浮于500μl低渗DNA染色液中(1g/LSodiumCitrate,0.1%TritonX100,100mg/LRNase,50mg/LPropidiumIodode),4℃保温30min 后,经流式细胞仪分析凋亡细胞及细胞周期时相分布，计算细胞增殖指数（PI）。
PI=（S+G2/M）÷(G1+S+G2/M)×100%
2.4花椒挥发油对H22荷瘤小鼠移植瘤生长的影响取对数生长期H22细胞,以RPMI1640调整细胞浓度为5×106/ml,于BALB/c小鼠左侧下腹部行无菌皮下接种0.2ml细胞悬液。
接种24h 后将BALB/c小鼠随机分为5组,给药剂量分别为10，25，50mg/kg体重和100mg/kg体重，阴性对照组给予等量无菌生理盐水(NS)，每组小鼠10只，隔日腹腔注射给药0.2ml/只，连续给药7次。
停药后次日处死小鼠，剥出瘤体称重并测量体积，计算肿瘤生长抑制率（IR）。
肿瘤生长抑制率（IR，％）=（对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重）/对照组平均瘤重×100% 2.5花椒挥发油对荷瘤小鼠血清中IL-2和IL-12水平的影响各组小鼠停药后次日采用眼球摘除法取血，静置后离心分离血清，ELISA法检测花椒挥发油处理后荷瘤小鼠血清中IL-2和IL-12的活性。
2.6统计学处理数据用±s表示,采用组间t检验进行统计分析。
3结果
3.1花椒挥发油抑制H22细胞的增殖花椒挥发油对H22细胞增殖呈明显抑制作用，且这种抑制随药物浓度加大和药物作用时间延长而增加（图1）。
花椒挥发油浓度为4mg/ml时，24h 抑制率为19%,48h抑制率为45%,72h抑制率为76%。