LUOYANG NORMAL UNIVERSITY 2010年酶工程学年论文分子酶工程研究进展院（系）名称生命科学系专业名称生物科学学生姓名李艳艳学号101314022指导教师程彦伟完成时间2013年12月分子酶工程研究进展李艳艳（生命科学系生物科学专业学号：101314022）摘要：酶工程的研究已经发展到分子水平，通过基因操作，已实现了许多酶的克隆和表达定点突变成为研究酶结构与功能的常规手段，并被广泛用于改善酶的性能。
体外分子进化方法则大幅提高了酶分子的进化效率，并有可能发展新功能酶。
融合蛋白技术的发展使构建新型多功能融合酶成为可能。
这里对分子酶工程学的研究与发展情况进行了综述。
关键词：分子酶工程；基因克隆；改造；定向进化；融合；人工模拟酶，由于其特异和高效的催化作用，在生命活动中扮演重要的角色。
其中，尤其是源于微生物的酶。
很早就被广泛开发服务于人类的各种需求，如酿造、酶法转化、疾病诊断与治疗、药物生产、环境污染物去除，等等。
然而，天然酶常常十分昂贵，且大多数酶由于非常“娇嫩”而难以实际应用。
近年来，结构生物学和基因操作技术的发展使得科学家能够对酶分子进行有效地改造，甚至开始为“目的”而设计，从而导致了分子酶工程学的发展。
概括地说，分子酶工程学就是采用基因工程和蛋白质工程的方法和技术，研究酶基因的克隆和表达、酶蛋白的结构与功能的关系以及对酶进行再设计和定向加工，以发展性能更加优良的酶或新功能酶。
当前的研究热点可以概括为3个方面：一是利用基因工程技术大量生产酶制剂；二是通过基因定点突变和体外分子定向进化对天然酶蛋白进行改造；三是通过基因和基因片段的融合构建双功能融合酶。
1 酶的基因克隆与异源表达天然酶在生物体中含量一般较低，难以提取和大量制备。
限制了它的推广应用。
重组DNA技术的建立，使人们可以较容易地克隆各种各样天然的酶基因，并将其在微生物系统中高效表达，从而在很大程度上摆脱对天然酶源的依赖。
这一技术已成功地应用于酶制剂的工业生产。
世界上最大的工业酶制剂生产商丹麦Novozymes公司生产的酶制剂80％为基因工程产品。
我国在这个领域中也取得了令世人瞩目的研究成果。
黄日波教授研究小组从广西象州温泉中分离到一株硫矿硫化叶菌，并根据基因序列库Genbank中提供的麦芽寡糖基海藻糖合酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶的DNA基因序列，利用PCR技术从中克隆到MTSase和MTHase，分别构建了含MTSase、MTHase基因的表达载体pHp-Jkint，将其分别整合到汉斯多形酵母染色体中，成功地构建了生产海藻糖工程菌，其表达量达60万U几MTSase和3万U／L MTHase。
经这2个酶的联合作用，使木薯淀粉中葡萄糖以80％的转化率转化为海藻糖，现已投入工业化生产。
2 酶分子的定向改造和进化酶分子本身蕴藏着很大的进化潜力，许多功能有待于开发。
分子酶工程设计可以采用定点突变和体外分子定向进化两种方式对天然酶分子进行改造。
定点突变需要知道酶蛋白的一级结构及编码序列，并根据蛋白质空间结构知识来设计突变位点。
体外定向进化是近几年新兴的一种蛋白质改造策略，可以在尚不知道蛋白质的空间结构，或者根据现有的蛋白质结构知识尚不能进行有效的定点突变时，借鉴实验室手段在体外模拟自然进化的过程(随机突变、重组和选择)，使基因发生大量变异，并定向选择出所需性质或功能，从而使几百万年的自然进化过程在短期内得以实现。
2．1 定点突变定点突变技术可以随心所欲地在已知DNA序列中取代、插入或缺失一定长度的核苷酸片段。
该方法与使用化学因素、自然因素导致突变的方法相比，具有突变率高、简单易行、重复性好的特点。
利用定点突变技术对天然酶蛋白的催化性质、底物特异性和热稳定性等进行改造已有很多成功的实例。
葡萄糖异构酶是工业上大规模以淀粉制备高果糖浆的关键酶，也是国际上公认的研究酶催化机制及建立蛋白质工程技术最好的模型之一。
为提高葡萄糖异构酶的热稳定性，朱国萍等人用双引物法对葡萄糖异构酶基因进行了体外定点诱变，以Pro138替代Gly138，在酶比活相近的情况下，突变型葡萄糖异构酶的热半衰期比野生型长一倍，最适反应温度提高10～12~C。
据分析，可能由于Pro138替代Gly138引入的一个吡咯环刚好能够填充Gly138附近的空洞，使突变蛋白的空间结构更具刚性，从而提高了酶的热稳定性。
然而，定点突变技术只能对天然酶蛋白中少数的氨基酸残基进行替换，酶蛋白的高级结构基本维持不变，因而对酶功能的改造较为有限。
同时，由于已有的结构与功能相互关系的信息远远不能满足当今人们对蛋白质新功能的要求，因此目前采用体外分子定向进化的方法来改造酶蛋白的研究越来越多，并已在短短几年内取得了令人瞩目的成就。
2．2 易错PeR易错PCR是一种相对简单、快速、廉价的随机突变方法。
它通过改变PCR 反应条件，如降低一种dN11P的量(降至5％～lO％)、以dI1]P来代替被减少的dN1P等，使碱基在一定程度上随机错配而引入多点突变。
Arnold等通过易错PCR 对枯草杆菌蛋白酶E进行了系列体外进化研究，经筛选得到几个在高浓度的二甲基甲酰胺(DMF)中酶活力明显提高的突变株181。
DNA改组则是1994年由美国的Stemmer提出的，这种方法不仅可以对从随机突变文库中筛选出来的一组突变基因人为进化，还可以将具有结构同源性的几种基因进行体外重组，共同进化出一种新的蛋白质。
通过这种方法产生的多样性文库，可以有效积累有益突变，排除有害突变和中性突变，同时也可实现目的蛋白质多种特性的共进化。
3 融合蛋白与融合酶蛋白质的结构常常可以允许某个结构域的插入与融合。
DNA重组技术的发展与应用使不同基因或基因片段的融合可以方便地进行，融合蛋白经合适的表达系统表达后，即可获得由不同功能蛋白拼合在一起而形成的新型多功能蛋白。
目前，融合蛋白技术已被广泛应用于多功能工程酶的构建与研究中，并已显现出较高的理论及应用价值。
随着基因组、后基因组时代的到来和重组酶生产技术的开发，必将会有大量的、新的酶蛋白被人类发现。
近来国际上又提出蛋白质全新设计(protein de o design)的概念，这一新技术可以用于组建自然界原先并不存在的、结构和功能全新的酶蛋白I 。
经计算，3oo个氨基酸残基可组成1039o种不同序列的蛋白质。
而整个生物出现的时期，自然界只发现有1055种蛋白质，绝大多数序列及新功能的蛋白质或酶在3O亿年生物进化中仍未发生，这有待于我们去开发和创造益于人类的新功能蛋白质。
4 酶的人工模拟模拟酶是根据酶作用原理，用人工方法合成的具有活性中心和催化作用的非蛋白质结构的化合物。
它们一般都具高效和高适应性的特点，在结构上比天然酶简单；由于不含氨基酸，其热稳定性与pH稳定性都大大优于天然酶。
目前用于构建模拟酶的模型有环糊精、冠醚、卟啉和分子印迹等。
利用环糊精已经成功地模拟了胰凝乳蛋白、转氨酶等。
下面主要介绍抗体酶和分子印迹技术。
4．1 抗体酶制备抗体酶的方法主要有诱导法、拷贝法、插入法、化学修饰法和基因工程法。
这些方法综合运用了现代化学、免疫学和现代分子生物学的成就，使抗体的类型越来越多。
此外用基因工程法改造或构建全新抗体酶是很有前途的方法，建立抗体基因组合文库，对单抗及其相应基因的序列分析，对建立抗体结合部位进行基因定位突变及臵换有催化功能的氨基酸，是制备基因工程抗体酶的主要内容。
国内也有许多学者在进行此类研究。
廉革伟等模拟生物体内一族重要的含硒酶——甲状腺素脱碘酶，制备催化甲状腺素脱碘的含硒抗体酶。
他们用杂交瘤技术制备出抗甲状腺素的单克隆抗体4C5，再用化学修饰法将催化基团硒代半胱氨酸引入到抗体的抗原结合部位，得到含硒抗体酶Se4 C5；通过RIA方法测定抗体酶活力。
4．2 分子印迹技术分子印迹技术是将待分离的目标分子(模板分子)与交联剂在聚合物单体溶液中进行聚合制备得到固体物质，然后通过物理或化学手段除去介质中的目标分子，便得到“印迹”有目标分子空间结构和结合位点的分子印迹聚合物。
目前，分子印迹技术已被应用于手性物质拆分、仿生传感器、固相萃取、抗体模拟、酶催化模拟以及控释药物等领域中。
清华大学隋洪艳等利用分子印迹技术的共价法制备了对L一特丁氧羰基色氨酸或D一特丁氧羰基色氨酸印迹的丙烯酰胺分子印迹聚合物，目的是利用分子印迹技术手性分离氨基酸衍生物。
色谱评价结果表明，印迹分子L—Boc—Trp的离解常数(3．287 mmol／L) 要小于非印迹分子D—Boc —Trp的离解常数(4．379 mmol／L)，说明分子印迹聚合物对印迹分子具有特异亲和作用。
采用扫描电镜和红外光谱等物理化学表征技术从结构上对这种特异性作了进一步的分析。
结果表明，分子印迹聚合物是一种具有多层次结构的聚合物，为溶质的扩散提供了良好的通道；在聚合物表面存在可与印迹分子相互作用的官能团。
系统研究了乙腈流动相中甲醇、乙酸和水的体积分数变化对分子印迹聚合物手性拆分效果的影响。
分子印迹技术可用于合成稳定性好的人工酶，也可用于手性药物及化合物的分离纯化及生物分子的识别检测，并可作为生物传感器检测的分子识别元件。
Mosbach发展了一种基于分子印迹技术的光纤传感器装臵，具有手性识别能力，能识别荧光标记的氨基酸衍生物。
总之，分子印迹技术自问世以来，便得到了人们的广泛关注，它将在酶工程发展中发挥越来越重要的作用。
5 展望随着基因组、后基因组时代的到来和重组酶生产技术的开发，必将会有大量的、新的酶蛋白被人类发现，一个重要的表现是从极端环境微生物或不可培养微生物获得酶的努力正在迅速增长。
而体外指导进化与高效筛选方法的结合，则大幅度提高了酶分子的进化效率，加速了人类改造蛋白质旧功能和开发新功能的步伐。
当然，分子酶工程学的进一步发展还要依赖于各种酶分子结构生物学数据的完善以及蛋白质空间结构预测和蛋白质结构和功能关系的深入研究。
近来国际上又提出蛋白质全新设计的概念，这一新技术可以用于组建自然界原先并不存在的、结构和功能全新的酶蛋白。
尽管目前对蛋白质全新设计的理论基础的认识还不够深入，蛋白质全新设计还处在探索阶段。
然而，我们相信，即使无法准确地从蛋白质序列预测蛋白质的结构及功能，对蛋白质折叠规律的不断了解及酶蛋白设计经验的不断积累必将使蛋白质全新设计的成功率不断提高。