华南师范大学生命科学学院生物工程下游技术实验报告实验一酵母RNA的提取及含量测定（紫外吸收法）实验二黑曲霉β-D甘露聚糖酶的纯化盐析实验三盐析β-D甘露聚糖酶活力测定实验四柠檬酸摇瓶发酵及结晶提取姓名： _义忠仁Ricky_学号：指导教师：江学文实验一酵母RNA的提取及含量测定一、实验目的与要求1、了解并掌握稀碱法提取RNA的原理和方法。

2、熟悉和掌握紫外吸收法测定核酸含量原理和操作方法，3、熟悉紫外分光光度计的基本原理和使用方法。

二、实验原理由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也很各异。

一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。

其中苯酚法又是实验是最常用的。

组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中。

向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好的除去DNA和蛋白质。

上述方法提取的RNA具有生物活性。

工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，用这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。

浓盐法使用10%左右氯化钠溶液，90℃提取3-4h，迅速冷却，提取液经离心后, 上清液用乙醇沉淀RNA。

稀碱法使用稀碱使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。

酵母含RNA达2.67-10.0%，而DNA含量仅为0.03-0.516%，为此，提取RNA多以酵母为原料。

核酸、核苷酸及其衍生物的分子结构中的嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统（-C=C一C=C-），能够强烈吸收250-280nm 波长的紫外光。

核酸（DNA,RNA）的最大紫外吸收值在260nm 处。

遵照Lambert-Beer 定律，可以从紫外光吸收值的变化来测定核酸物质的含量。

在不同pH 溶液中嘌呤、嘧啶碱基互变异构的情况不同，紫外吸收光也随之表现出明显的差异，它们的摩尔消光系数也随之不同。

所以，在测定核酸物质时均应在固定的pH溶液中进行。

核酸的摩尔消光系数（或吸收系数），通常以ε（ρ）来表示，即每升含有一摩尔核酸磷的溶液在260nm 波长处的消光值（即光密度，或称为光吸收）。

核酸的摩尔消光系数不是一个常数，而是依赖于材料的前处理、溶液的pH 和离子强度发生变化。

RNA 溶液（pH = 7.0）的ε（ρ）= 7 700-7 800，RNA 的含磷量为9.5%，含1μg /mL RNA 溶液的光密度为0.022-0.024。

因此，测定未知浓nm，即可计算测出其中核酸的含量。

该法简度的DNA（RNA）溶液的光密度OD260单、快速、灵敏度高，如核酸3μg/mL 的含量即可测出。

对于含有微量蛋白质和核苷酸等吸收紫外光物质的核酸样品，测定误差较小。

蛋白质由于含有芳香族氨基酸，因此也能吸收紫外光。

通常蛋白质的吸收高峰在280nm 波长处，在260nm 波长处的吸收值仅为核酸的十分之一或更低，故核酸样品中的蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。

三、主要仪器和试剂啤酒酵母粉0.04M NaOH溶液95%乙醇、乙醚、酸性乙醇溶液：30mL乙醇加0.3mL HCl。

紫外分光光度计离心机真空干燥箱三角瓶、烧杯水浴锅四、实验步骤1、称取2g干酵母粉，用30mL 0.04M NaOH溶液分步在研钵中研磨均匀后，转入2支50ml比色管，沸水浴加热45min，冷却，转入离心管，4000r/min，离心15min，将上清慢慢倾入装有10mL酸性乙醇的离心管，边加边搅动。

2、加毕，静置，待RNA沉淀完全后，5000r/min离心5min。

弃去上清液。

用95％乙醇分步将沉淀转移至布氏漏斗抽滤并洗涤，消耗95％乙醇体积总约30ml；3、再用乙醚洗涤沉淀两次，消耗体积总约20ml，沉淀在空气中干燥。

称量所得RNA粗品的重量（减去滤纸重量），并记录该数据。

4、RNA粗品中RNA纯度测定：将样品配制成含5～50μg核酸/mL的溶液：将上述RNA粗品溶解于100ml容量瓶，定容，静置，取上清液于紫外分光光度计上测定260nm 吸收值，按下式计算纯品RNA 浓度。

若O.D 260读数过大，则根据O.D 260值再做适当稀释。

滤纸重m1＝0.32425gRNA 粗品重量m2=0.4603g吸光度O.D 260＝0.100五、计算：%)3(1,;/1024.0;260.10024.0./)2(;2;%,50%2)1(2606260⨯=----⨯⨯⨯⨯-⨯-⨯=-=量抽滤干燥粗品浓度纯品含量；，比色杯厚度（非壁厚）；定容体积毫升吸光度微克纯品吸光度量抽滤干燥粗品量抽滤干燥粗品毫升）浓度（微克纯品啤酒酵母，量抽滤粗品量抽滤干燥粗品量抽滤干燥粗品产率定容定容RNA RNA RNA L ml V RNA nm D O RNA RNA V L D O RNA g g RNA RNA RNA RNA 抽滤干燥粗品RNA 量＝（0.4603－0.32425）×50%＝0.068025gRNA 产率＝3.4%纯品RNA 浓度＝2.08×10-4克／克干酵母RNA 含量＝0.31% 六、思考题1. 破酵母细胞时为什么要在沸水浴中进行?答：沸水浴的作用主要是破碎酵母细胞，使胞内蛋白质变性，并破坏RNA 水解酶活性来保护RNA 。

由于酵母细胞外有一层厚厚的细胞壁，而RNA 存在于细胞质中，所以必需将酵母细胞的细胞壁研磨破碎后才能提取出RNA。

加入NaOH之后水浴煮沸35min的作用是促进细胞壁变性，使类脂、甘露聚糖、葡聚糖等成分部分分解，使蛋白质变性，从而使细胞破裂，RNA则从细胞中分离出来。

另外细胞中含有多种分解RNA的酶类（如RNase等），为了避免RNA 在提取过程中被降解，得到较为完整的RNA分子，破碎酵母细胞时应在沸水中进行，这样可以使细胞中降解RNA的蛋白酶类活性受到抑制甚至变性失活，从而起到保护RNA分子的作用。

2.为什么用酵母作为实验原料？如何使RNA从酵母中释放出来？RNA的等电点是多少？答：因为酵母核酸中含RNA为2.67～10.0%，而DNA 含量仅为0.03～0.516％，而且菌体易收集，RNA 也易于分离。

因此，提取RNA多以酵母为原料。

RNA可溶于稀碱溶液，本实验中利用NaOH使细胞壁变性，可以使RNA从酵母中释放出来。

RNA的等电点为pH2.0-2.5.3. 为什么用稀碱溶液可以使酵母细胞裂解？答：酵母菌的细胞壁呈“三明治”结构——外层为甘露聚糖,内层为葡聚糖,中间层为一层蛋白质分子(包括多种酶类)。

此外细胞壁上还有少量的脂质和酶。

稀碱溶液可以分解膜壁上的脂质，使细胞穿孔。

在碱性溶液中，细胞壁上的甘露聚糖和葡萄糖会水解，蛋白质变性，而增加细胞通透性，细胞就会破裂释放RNA。

4.核酸的溶解性质是什么?常用什么试剂分离沉淀核酸?答：核酸均为极性化合物，微溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂。

DNA和RNA 可溶于10%氯化钠溶液但难溶于50%左右乙醇溶液，所以常用乙醇从溶液中分离沉淀核酸。

实验二黑曲霉β-D甘露聚糖酶的纯化一．实验目的1、粗酶的制备2、硫酸铵分级沉淀3、透析袋的处理方法和使用二．原理1、盐析原理；2、透析袋脱盐三．实验试剂和器材纱布1卷、脱脂棉1包、琼脂条1包、透析袋MWCO（分子量） 14000或7000。

四．实验步骤1、将黑曲霉ASP.Niger 菌株斜面接种三角瓶固体发酵培养基,30.5℃恒温培养72 h。

2、称取10克发酵麸曲，加100毫升pH5.6的醋酸缓冲液，温度37℃，转速135rpm，摇床摇60 min后，用￠15㎝滤纸过滤。

3、量取滤液40毫升，在不断搅拌下分步加入（NH4）2SO422.0克（待加入部分溶解后再加入剩余部分）。

4、置冰箱中5℃下静置、沉淀过夜。

5、标准曲线的绘制：分别吸取0.1 %标准甘露糖溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，于50mL比色管中，分别定容至25 mL。

再分别吸取上述溶液各2.5 mL置于25 mL比色管中，各加2.5 mL 3,5-二硝基水杨酸显色液（DNS试剂），置沸水浴5 min（另作1管对照，取2.5 mL蒸馏水，加2.5 mL DNS试剂，同样煮沸5 min）。

冷却后，再统一定容至10mL，用721型分光光度计在530 nm波长下比色，记录各管的光密度值，以光密度值作纵座标，对应标准甘露糖溶液浓度（微克/毫升，µg/mL）为横座标，绘制标准曲线。

五、实验结果表1 各管OD 值表组别0 1 2 3 4 5 甘露糖含量 mg/mL0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 OD 值 0 0.294 0.718 1.303 1.934 2.804 绘制标准曲线如下：图1甘露糖标准曲线六、思考题1、（NH 4）2SO 4沉淀蛋白质的原理是盐析，与其它盐相比其优点有那些？ 答：（NH4）2SO4与其他常用盐类相比有十分突出的优点：1) 溶解度大：由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，因而盐析也要求在低温下进行。

硫酸铵在低温时仍有相当高的溶解度，而且远远高于其它盐类。

2) 分离效果好：有的提取液加入适量硫酸铵盐析，一步就可以除去75％的杂蛋白。

3) 不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。

4) 价格便宜，废液不污染环境。

2、影响盐析的因素有那些？答：影响盐析的因素有以下几点：1)溶液温度：蛋白质溶解度在一定范围内随温度增加而增加。

2)pH 值：当pH 值接近蛋白质的等电点时盐析效率高。

3)蛋白质浓度：适当高浓度的蛋白质可提高盐析效率，但过高会发生共沉淀作用。

过低浓度所用盐量较高。

4)离子强度：一般说来，离子强度越大，蛋白质溶解度越低。

实验三盐析β-D甘露聚糖酶活力测定一．实验目的1、掌握β-D甘露聚糖水解各种甘露聚糖之间β糖苷键的机制和理论。

2、掌握以魔芋精粉为底物测定发酵制品中β-D甘露聚糖活力的操作方法。

二．基本原理水解含B一1，4甘露糖苷键的甘露多糖(包括甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡萄甘露聚糖等)的内切水解酶，属于半纤维素酶类。

B一甘露聚糖酶能将广泛存在于豆类籽实中的甘露聚糖降解为甘露低聚糖，不仅消除了甘露聚糖对单胃动物的抗营养作用，同时生成的甘露低聚糖在动物肠道中起着重要的调节作用。

三、实验试剂和器材721型分光光度计、恒温水浴锅、秒表。

pH5.6的醋酸缓冲液四、实验步骤1、倾去部分上清液，立即将沉淀部分在8000rpm，离心10min。

收集沉淀，加约20毫升蒸馏水溶解，倒入事先准备好的透析袋中。

（透析袋处理：剪成15㎝长度，沸水浴中煮10min，捞起、扯开，在一端1㎝处用细绳扎紧口，用水试一下是否有漏，若有漏需重新绑扎，直至不漏为止。

处理过程中需戴手套！）2、酶液倒入透析袋后，另一端1㎝处也用细绳（应用长一点的！）扎紧口，浸于4～5℃的蒸馏水中（250ml烧杯），持续时间1.0h，并不时搅拌，期间每隔20min更换1次4～5℃的新鲜蒸馏水，以利迅速达到平衡，每次用水量约150毫升。