即与相比有关； d. K与k’是衡量色谱柱对组分保留能力的参数；
K与k’值越大，保留时间越长；
31
④分离度：相邻色谱峰峰顶之间的距离除 以此两色谱峰的平均宽度。
Rs1/2t(R2b 1 tR1b2)
2tR b1 b2
32
⑤柱效率：
N 5.54( tR )2
1/ 2
HL N
N 16( tR )2
根据分离的物 吸附色谱法
理化学原理
分配色谱法
色谱法分离原理
分配系数 分配比
色谱图
色谱图相关述语 色谱图所提供的信息
塔板理论
色谱法基本理论
速率理论 分离度
色谱分离的基本方程
利用保留值定性
色谱定性分析 利用经验规律定性
色谱定性定量分析
利用联用技术定性 定量校正因子
色谱定量分析 峰面积测量
归一化法
定量分析方法 内标法
柱 色 谱 法 （ L C C ）空 心 柱
色 谱 法
毛 细 管 柱
平 板 色 谱 法 （ F B C ） 纸 薄 色 层 谱 色 法 谱 法 （ P （ C T ） L C 1） 0
③按分离的动力学过程分：
冲 洗 色 谱 法 色 谱 法 顶 替 色 谱 法
迎 头 色 谱 法
④按分配原理分：
色谱法
b
N有效N(1k'k')2 H有效H(1k'k')2
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2.色谱理论模型
色谱分离过程涉及到两个方面：其一是色谱分离与 物质在两相中的分配系数有关——这由物质（包 括组分、流动相、固定相）的分子结构和性质决 定——这也就决定了各组分在柱后的出峰时间， 即色谱过程中的热力学因素；其二是色谱分离与 物质在柱内的运动情况有关—这由物质在流动相 和固定相间的传质阻力决定—这也就决定了各组 分色谱峰的形状和区域宽度，即色谱过程的动力 学因素。
第6章 色谱分离过程
Chromatography
6.1 概述 6.2 色谱分离过程的基本原理 6.3 色谱的分类 6.4 色谱分离过程基础理论 6.5 典型制备色谱工艺及应用
1
色谱分析法 的基本知识
色谱定义及分类
色谱法定义 色谱法分类
根据两相的 物理状态
气相色谱法 液相色谱法
气固相色谱法 气液相色谱法 液固相色谱法 液液相色谱法
✓ 分离机制：见图示
吸附平衡 Xm + nYa→Xa + nYm
13
✓ 分离机制： 各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心 利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离
吸附→解吸→再吸附→再解吸→无数次洗脱→分开 14
（二）分配色谱法
✓ 要求：
固定相→机械吸附在惰性载体上的液体
流动相→必须与固定相不为互溶
色带
4
1903年俄国植物学家Tswett实验示意图
色谱法的特点
✓ 优点：“三高”、“一快”、 “高一选广择性”——可将性质相似的组分分开
高效能——反复多次利用组分性质的差异
产生很好分离效果
高灵敏度——10-11~10-13g，适于痕量分析 分析速度快——几~几十分钟完成分离
一次 可以测多种样品
应用范围广——气体，液体、固体物质
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塔板理论基本假设
色谱柱由一系列塔板组成 塔板内，组分在两相间迅速达到平衡 （理想色谱） 组分的分配系数不随它的浓度变化而 变化（线性分布等温线） 组分的轴向扩散为零 流动相的流动是跳跃过程
37
38
塔板理论方程：
N 5.54( tR )2
1/ 2
H=L/N
若扣除死时间（体积）的影响，得到有效塔板数（n’）和有效塔 板高度(H’)：
溶解和解析的能力（或吸附和脱附的能力）
的大小，以一定的比例分配在固定相和流动
相之间。溶解（吸附）能力大的组分分配给
固定相多一些，分配给流动相少一些。这可
用分配系数K表示。
6
分配系数的微小差异→吸附能力的微小差异 微小差异积累→较大差异→吸附能力弱的组分先流出；
吸附能力强的组分后流出 7
2.固定相（色谱柱填料）
气 相 色 谱 法 （ G C ） 气 气 固 液 色 色 谱 谱 法 法 （ （ G G S L C C ） ） 色 谱 法液 相 色 谱 法 （ L C ） 液 液 固 液 色 色 谱 谱 法 法 （ （ L L S L C C ） ）
超 临 界 流 体 色 谱 法
②根据固定相的形状分：
填 充 柱
1.根据色谱峰的数目，可以判断试样中所含 有组分的最少个数。
2.根据色谱峰的保留值可以进行定性分析。 3.根据色谱峰高或面积可以进行定量测定。 4.根据色谱峰间距及其宽度，可对色谱柱的
分离效能进行评价。 5.色谱峰间距——固定相或流动相选择是否
合适的依据。
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6.4 色谱分离过程基础理论
1.保留值、分离度和柱效率
外标法
2
6.1 概述
1. 定义——也称色谱层析、色谱、色层； 样品中各组成依据其在固定相与流动相 之间作用行为的差别进行多次分离的过 程。
2. 发展史——1903年一位俄国植物学家 首次提出。1931年首次应用于制备； 1938年适用范围扩展至无色物质；……
3
➢ 固定相——CaCO3颗粒 ➢ 流动相——石油醚
分子排阻色谱或凝胶过滤色谱 离子交换色谱 疏水作用色谱 亲和色谱 正相/反相谱
11
基本类型色谱法的分离机制
基本概念：固定相（s）；流动相（m）
（一）吸附色谱法 （二）分配色谱法 （三）离子交换色谱法 （四）空间排阻色谱法
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（一）吸附色谱法
✓ 要求： 固定相→吸附剂（硅胶或Al2O3） 具表面活性吸附中心
H A BCu u
式中A、B、C为常数，A为涡流扩散项，B为分子扩散项系数，
✓ 分离机制见图示
✓ 阳离子交换树脂 RSO3-H+ + X+ → RSO3-X+ + H+
固定离子 可交换离子 待测离子
17
图示
✓ 分离机制： 依据被测组分与离子交换剂交换能力（亲和力） 不同而实现分离 back
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（四）空间排阻色谱法
✓ 要求： 固定相→多孔性凝胶 流动相→水——凝胶过滤色谱 流动相→有机溶剂——凝胶渗透色谱
k'
tR tR0 tR0
tR tR0
1
③K与k’之比较：
;β
cm mm/Vm VS
式中，β为相比，为柱中流动相体积与固定相体积之比。它反 映了柱型的特点：填充柱β=6—35；毛细管柱β=50-1500。
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a. K和k’与物质及两相的性质有关； b. K 与k’都是温度、压力的函数； c. K与两相的体积无关；k’与两相的体积有关，
③调整保留时间（t’R）--扣除死时间后的保留时间 （t’R=tR-tM）。
用使组分流出色谱柱所需流动相体积表示时为：
a．死体积（Vm） b．保留体积（VR） c．调整保留体积（V’R）
VM=tMF0 VR=tRF0 V’R=t’RF0=VR-VM
25
(3)峰高与峰面积 峰高是色谱峰的顶点到基线之间的垂直距 离，用h表示；峰面积是色谱流出曲线与基线所围成的面积， 用A表示。
N'5.54t1R '/2
2
16tR ' 2
H’=L/N’
39
它们比理论塔板数及高度，能更有效地反映色谱分 离好坏与塔板数和塔板高度之间的对应关系。
一般说来，色谱柱的理论塔板数越大，表示组分在 色谱柱中达到分配平衡的次数越多，越有利于分离， 但不能说明组分间分离的好坏，因为分离好坏决定 于各组分在流动相和固定相之间分配系数的差别， 而不是分配次数的多少。
①硅胶衍生的固定相
②离子交换树脂
③大孔吸附树脂
④凝胶 ⑤手性固定相
纤维素衍生物 环糊精相 聚（甲基）丙烯酰胺 π -酸和π -碱固定相
8
3.色谱柱及柱技术
高压匀浆填充
色谱柱装填方法 干法填充
径向压缩法 轴向压缩法 环形压缩技术
色谱柱设计
“饼式”柱 面进样
轴向流动 9
6.3 色谱的分类
① 根据色谱法中两相的物理状态分：
(4)区域宽度 是反映分离好坏的一个重要参数。一般，区域 宽度越窄越好。可用三种方法表示：
①标准偏差（σ）：0.607倍峰高处峰宽的一半。 ②峰底宽度（ω）：色谱峰两侧切线在基线上的截距 ω =4σ ③半峰宽度（ ω 1/2）：又称半宽度或区域宽度，峰高一半处
的宽度。
1/2 2.354
26
27
从色谱流出曲线可以获得许多重要信息：
34
• 色谱理论包括两方面: –热力学理论：研究分配(分离)过程， 塔板理论（plate theory）。 –动力学理论：研究各种动力学因 素对峰展宽的影响，速率理论 （rate theory）。
35
塔板理论 (the plate model)
1941年，Martin和Synge阐明了 色谱、蒸馏和萃取之间的相似性， 将色谱柱设想成由许多液液萃取单 元或理论塔板组成；与精馏相似， 色谱分离也是一个分配平衡过程。 这就是Martin等人提出的塔板理论。
✓ 缺点：
化学、生化色谱分离、分析
对未知物分析的定性专属性差
需要与其他分析方法联用(GC-MS,LC-MS)
5
6.2 色谱分离过程的基本原理
1.分离原理
色谱法之所以可以分离混合物，关键是它有一
个高效的色谱柱。物质在柱内的分离过程，
是物质在固定相和流动相之间发生吸附、脱
附（或溶解、解析）的过程。被分离物按其
载体→惰性，性质稳定，
不与固定相和流动相发生化学反应