由于整合后控制合成性伞毛的基因位于DNA环的末 端, 一般尚未进入受体细胞前，接合管就已经断裂，使 转移中断，故Hfr杂交的后代不能获得合成性伞毛的基 因，故不能产生性伞毛而呈F－的性状。
第四节 中断杂交与重组作图
一、中断杂交实验原理
基因从Hfr 细胞按次序转入F-细胞，可根据基因进入F细胞的时间和次序制作基因图谱。 Wollman和Jacob 于1954年在大肠杆菌中曾进行了以下杂交实验：
• 它既能以自主状态存在于细胞质中，又能整合到细 菌的染色体内。
• F小环与主染色体大环之间发生一 次交换就可以插入到宿主染色体中 。
• F因子整合到E.coli染色体上以后， 该菌株就成为高频重组株（High frequence rebination ），以Hfr表 示。
Mechanism of DNA transfer during conjugation in Gram-negative bacteria
• Gram-negative（阴性菌）: sex pilus（ 性菌毛）
F因子的特征
• 携带F因子的菌株称为供体菌或雄性，用F+表示。 没有F因子的菌体称为受体菌，又称雌性，用F－表 示。
• F因子是双链环状DNA，分子量大约是3.5×106， 是染色体外遗传物质，是质粒的一种，在分类学上 属于附加体（episome）。
质粒介导的染色体DNA的转移
Formation of Hfr strains
Hfr细 胞的转 移
F+品系称为低频重组（low frequency rebination，Lfr)：F因子转移频率很高， 但两者染色体之间重组频率很低，大约是 每百万个细胞发生一次重组。
Hfr品系称为高频重组（ high frequency rebination，Hfr）：因为Hfr细胞与F-细胞 接合后可以将供体染色体的一部分或全部 传递给受体F-，当供体和受体的等位基因 带有不同标记时，在她们之间就可以发生 重组，重组频率可达到0.01以上。
基因
转入时间（ min） 频率
thr+
8
100
leu+
8.5
100
azs
9
90
Tis
11
70
lac+
18
40
gal+
25
25
不同基因在F-中出现的时间和达到的稳定转移 频率不同，表明它们同转移起始点之间，以及 它们之间的顺序和距离不同。
0 5 10 15 20
O
az Ti
lac
25 min gal
Hfr：thr+leu+azsTislac+gal+strs× Байду номын сангаас-:thr-leu-azrTirlac-gal-
strr把接合中的细菌在不同时间取样，并把样 品猛烈搅拌以中断接合中的细菌，然后分析 受体菌的基因型，这是在大肠杆菌等细菌中 用来测定基因位置的一种方法。
二、中断杂交作图 中断杂交实验结果
第一节 接合（Conjugation）
概念：
F+ conjugation Hfr (high frequency rebinant) conjugation
•接合是指DNA从活的供体细胞转移至受体 细胞的过程。
•输出遗传物质的个体称为供体（donor），又称 为“雄性”。接受外源遗传物质的个体称为受体 （receptor），又称为雌性
E.coli中断杂交作图
大肠杆菌 F因子的遗传图谱
oriT ：origin of transfer
The oriT sequence
1. About 300 bp 2. Contains inverted repeats and an AT-rich region.
细菌结合的过程
1. Donor（供体） and the recipient（受体） cell contact and mating（配对） bridge formation,
当处于游离状态时，细菌为F＋，当整合到宿主染色 体上时即为Hfr品系。所以经吖啶橙处理不会丢失F因 子。 Hfr和F－细胞接触时OriT活化，进行滚环复制。开 始时，缺刻蛋白识别并结合在OriT区，切开单链，以 另一条链为模板，在3′-OH上从头合成。5′端沿箭头方 向延伸，将宿主的DNA移到受体中。
第六章 微生物基因转移
微生物基因的交流
基因重组：是指来自两种不同亲本的
DNA分子在同一生物体内经过交换作用 产生新的重组DNA分子的现象。
细菌遗传重组的自然机制包括
细菌的接合（conjugation） 转化（transformation） 转导 （transduction） 性导（sexduction ）
1946年，Leaderberg和Tatum发现E.coli可以通 过结合交换遗传物质。选用两个不同营养缺陷型 （auxotroph）的E.coli菌株，A和B。
A菌株，met－bio－，需要在基本培养基上补充 甲硫氨酸（met）和生物素（bio）才能生长；
B菌株，thr－leu－，需要在基本培养基上补充 苏氨酸（thr）和亮氨酸（leu）才能生长。
采用多营养缺陷型是为了防止回复突变干扰试验 结果。
U型管试验(见图） 说明：两个菌株间的直接接触是原养型
细菌出现的必要条件，这就排除了转化的 可能。
1952年，Hages通过实验证明，在结合过 程中，遗传物质的转移是单向的。
在结合过程中，到底是什么东西由雄体输 入了雌体呢？
• Gram-positive: sticky surface molecules
2. DNA relaxosome（松散） formation initiated（启动） by a single-stranded nick within the oriT,
3. conjugative （结合）“rolling circle” replication （复制）and single-stranded DNA transfer to the recipient（受体）, 4. DNA recircularization, plementary strand synthesis, and vegetative replication in the recipient.