车行驶在月色下的加利福尼亚山间公路上时想出
来的”。
发展过程：
开始使用大肠杆菌•DNA聚合酶Klenow片段，
该酶不耐热，每次加热变性DNA后都要重新补加。
耗时、费力、易出错。耐热DNA聚合酶的应用使
得自动化。
生命经纬
专利官司 1987年美国专利局专利授权 1989年，DuPont异议，大小公司对簿公堂，将 决定谁将获得诺贝尔奖。DuPont理由是，1971 年PCR•的雏形已由Khorana一系列文章阐明，并 公布于众，应当是公共产权。斯坦福大学 Kornberg（研究DNA聚合酶获诺贝尔奖）也认 为，任何具备生物技术知识的人都可以从 Khorana等的文章中推知如何操作PCR。
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primes If the PCR product is to be cloned, it is sensible to include the sequence of unique restriction enzyme sites within the 5’-ends of the primers. Can amplify fragments over 10kb in length
the primers to bind, ❖ 72℃ polymerization step. ❖ Mg2+,dNTPs are required in addition to
template,primers,buffer and enzyme
生命经术。 Khorana（1971）：美国MIT教授、 1968年诺贝 尔医学奖得主 “经过DNA变性，与合适 引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并 不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。 核酸体外扩增最早设想遗忘:
Store:纯化引物在25％乙腈溶液中4℃； 冻干引物于-20℃可保存1-2年，液体 状态于-20℃可保存6个月。不用时应20℃保存。
美国专利局驳回DuPont异议，地方法院判属 Cetus Cetus获胜后马上反诉，指出DuPont已侵犯另一 项与•PCR有关的专生命利经纬并ww要w.bi求对方赔偿以及不再销 售与PCR有关试剂和仪器
PCR发展速度
惊人，没有一种技术能与之相比
引用论文最多、应用范围十分广泛
1993•年度诺贝尔化学奖：Mullis，与
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procedures
v template(DNA or RNA),
v primers, v Taq enzyme, v 10×PCR buffer, v Mg++, v 5mmol/L dNTPs
v pre-denaturation-denature completely
v Denaturation v annealing v Elongation v cycles:25-30
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Primer design
Most imp.
(1)length: 20～30bp (2)G+C contents:ATCG random distributed (3)primers : no complementary sequence (4)3‘end of the primer: no modification (5)5‘end of the primer:product length，can be modified (6) specificity:less than 70% homology with nonspecific amplification sequence, or 8bp continuous complementary base
开创了“寡核苷酸基因定点诱变”加
拿大籍英国科学家Michael Smith共
获
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原理
类似于DNA的体内复制。首先待扩增 DNA•模板加热变性解链，随之将反应混 合物冷却至某一温度，这一温度可使引物 与它的靶序列发生退火，再将温度升高使 退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。 这种热变性-复性-延伸的过程就是一个 PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种 循环的不断重复。
PCR(Polymerase Chain Reaction) Three steps: denaturation,
primer annealing, polymerization. Peoples Choice Reaction
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The PCR cycle
❖ 95℃ step to denature the duplex DNA, ❖ An annealing step of around 55℃ to allow
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Primer designed with the help of computer
DNA database conservative region comparision primers or blast
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PCR reaction components and their functions
当时很难进行测序和合成寡核苷酸引 物；
当时(1970)Smith等发现了内切酶， 体外克隆基因成为可能 生命经纬
Kary Mullis(1985)
发明过程
Mullis 在“偶然想出的聚合酶链反应”一文中写
到:
“这种简单得令人惊奇，可以无限量地拷贝
DNA片段的方法是在不可想象的情况下， 即驾
template：ssDNA, dsDNA mRNA needed to be RT as cDNA
samples：from blood,sperm or any other tissue,from older forensic specimens, from ancient biological samples or in the lab. From bacterial colonies or phage plaques. DNA：very stable