紫外可见分光光度计基本原理及分析技术紫外可见分光光度计基本原理与分析技术紫外可见分光光度计基本原理与分析技术允许打印和进一步使用原文来自Analytik Jena AG 2007版翻译：汪素萍目录1 定义和基本原理 (5)1.1 光的吸收及光谱 (5)1.2 透射和吸收 (6)1.3 定性分析 (6)1.3.1 光谱与结构 (6)1.3.2 影响光谱的因素 (7)1.3.3 定性信息 (7)1.4 定量分析 (8)1.4.1 Lambert-Beer 定律 (8)1.4.2 标准曲线的绘制 (8)1.4.3 用于光度测量的样品制备 (9)1.5 动力学 (9)1.6 UV VIS 分光光度计的更多应用 (10)1.6.1 蛋白和DNA 分析 (10)1.6.2 DNA熔点测定 (11)1.7 导数光谱 (12)1.7.1 色度分析 (13)1.7.2 膜厚度的测定 (14)2 UV VIS 分光光度计的结构 (16)2.1 UV VIS 分光光度计的组成 (16)2.2 光源 (16)2.3 分光系统 (16)2.3.1 单色器系统 (16)2.3.2 多色器系统 (17)2.4 光谱带宽 (18)2.5 样品室 (19)2.6 检测器 (19)2.7 单/双光束 (19)3 比色池 (20)4 UV VIS 分光光度计的附件 (23)4.1 简单池架一览表 (23)4.1.1 应用：快速测试池用于牛奶中钙的测定 (24)4.1.2 应用：微量池和可调池架用于DNA 分析 (24)4.2 流通池测量 (25)4.2.1 应用：用流通池定量测定磷酸盐 (25)4.3 多联池 (27)4.3.1 应用：多联池用于酶动力学 (27)4.4 用于固体样品测定的附件 (29)4.4.1 固体样品架和反射附件 (29)4.4.2 应用：SPECORD ®透射测量法测定膜厚度 (29)4.4.3 应用：积分球用于牙齿表面白和黄指数的测定 (30)4.4.4 应用：防晒霜的测定 (32)4.5 光纤探头 (33)4.5.1 应用：ATR 探头用于颜料测定 (33)1 定义和基本原理1.1 光的吸收和光谱电磁辐射与固体、液体或气体的相互作用产生各种现象，比如吸收、反射或散射。
UV VIS分光光度计是专用于研究紫外和可见范围内辐射与物质间相互作用的。
波长波数图 1 电磁辐射当原子或分子吸收电磁辐射就会从基态转变为高能态的激发态，在这一过程中吸收特殊波长的能量。
和原子相比，各种分子状态有着相当宽的能量范围。
在红外区受激，分子会转动和振动，而在可见和紫外区则可以通过价电子观察到特定能级(量子的吸收。
图 2：吸收和吸收光谱(抗坏血酸这些量子的能量可以用辐射的波长来定义。
波长越短，量子的能量越高。
各吸收点的位置和相对的吸收值的大小可以用UV VIS 分光光度计测定。
1.2 透射和吸收如果入射光的强度I 0 透过一个厚度为d 的介质，除反射和散射的损失外，光强度会因样品的特征吸收而减弱。
此时的出射光(透射强度为I 。
图 3：透射透射T 用以下公式定义：或样品的吸收值A 用以下公式表示：（公式 1）（公式 2）和透射形成对比，溶液的吸收随光强度的减弱而增加。
1.3 定性分析1.3.1 光谱与结构来自分子吸收带的UV VIS 光谱通常是相对较宽的。
和近红外光谱（产生许多窄带吸收）相比，提供的定性信息相对较少。
有机分子在UV VIS 范围内的吸收通常通过生色基团 (颜色表现的种类产生。
下表1中列出了各种生色基团及其最大吸收。
表1生色基团分子式实例最大吸收羰基-(酮羰基-(醛氨基2硝基2丙酮乙醛乙酰胺硝基甲烷羧基醋酸氮氮键重氮甲烷如果使生色基团与另一个共轭，吸收带会先相长波方向位移。
1,5-己二烯（无共轭）最大吸收185nm1,3,5-己三烯（无共轭）最大吸收250nm独特的环状不饱和烃在UV VIS 范围表现出非常有特点的吸收带。
图 4：苯蒸气的UV VIS光谱图1.3.2 影响光谱的因素对波长而言，精确值与特效取代基和溶剂二者有关。
通常随着溶剂极性的增加，吸收光谱会发生蓝移(向短波方向；随着溶剂极性的减弱，会红移(向长波方向。
表 2溶剂（极性逐渐增加）透射限于nm 处n-（正）己烷氯仿二乙醚乙醇水其他参数，比如pH 值和温度等，也会影响波长的位置和最大吸收强度。
1.3.3 定性信息UV VIS 分光光度计可以给出以下定性信息：z 纯物质的鉴定 z HPLC 分离后纯物质的鉴定（使用二极管阵列系统更合适）z 纯度测试（例如：蛋白质或DNA/RNA） z 蛋白和核酸的熔点曲线 z 饱和与不饱和化合物的识别 z 酮类和稀醇形态的识别 z 羰基带的鉴定 z 键合关系和取代效果的解析 z 酶活性1.4 定量分析1.4.1 Lambert-Beer 定律Bouguer-Lambert-Beer 定律表达吸收和浓度的关系。
Bouguer （1696－1758）吸收值与光程长度成正比 Lambert （1728－1777）Beer （1825－1863）吸收值与摩尔浓度成正比（公式 3）A(λ） - 吸收波长λε(λ） - 摩尔的对数吸收波长（L mol-1 cm-1） c - 浓度（mol L-1） d - 池程长（cm ）Lambert-Beer 定律是限定性定律，在以下情形下不成立：z 待测物质的浓度太高（> 0.01M/I； z 待测物质和溶剂间有副反应； z 使用的幅射线非单色；z 杂散光 (散射光，例如：由物体引起的反射现象。
这就意味着，Lambert-Beer 定律的正确性需要研究。
该研究为校准过程。
1.4.2 标准曲线的绘制绘制标准曲线就是测定已知浓度样品(标准溶液，用各浓度值和对应的各测定吸收值绘制的曲线。
Lambert-Beer 定律在校准曲线的线性范围内应用。
非线性校准曲线在一定程度上也是可以用的，这就扩展了校准范围。
图5：标准曲线1.4.3 用于光度法测定的样品制备在大部分情况下，须将各待测样品转化为有色化合物。
试剂的使用即为显色过程： z 自然界的无机物。
尽管广泛存在，但不被使用。
z 自然界的有机物。
已知的有机试剂超过7500种，我们看到的颜色是配位体键合和电荷转移化合物的结果。
表3 显示了可以用UV VIS分光光度计测定的参数选择，如下所示。
表3铝溴化物氯化物氟化物金碘钾铜锰钼钠镍硝酸盐亚硝酸盐臭氧苯酚磷酸盐不溶物氧银总氮硫酸盐硫化物亚硫酸盐阴离子表面活性剂TOC 过氧化物锌氨水铬酸盐铵铅硼镉氯次氯酸盐CSB 氰化物铁1.5 动力学动力学研究随吸收值变化对应的时间运行轨迹，也就是化学反应的速度。
图6：各最大吸收值的时间变化所表明的动力学测定结果的三维图。
这些时间变化值可用于求得反应速度（例如：随线性回归对应的斜率的测定）。
酶的浓度也可以以时间–溶解方式（动力学）测定。
这种方法测定的是酶基浓度随时间的变化。
测定的时间曲线的斜率与酶的浓度成比例。
图 7：用于动力学测定的部分数值以食品化学为例，用于动力学反应测定的一些重要参数见表 4。
表 4醋酸盐酒精甲酸维生素C 琥珀酸胆固醇柠檬酸盐甲醛果糖半乳糖葡萄糖谷氨酸盐甘油尿素联氨羟基丁酸异柠檬酸乳酸盐乳糖麦芽糖草酸蔗糖山梨(糖醇淀粉木糖醇1.6 UV VIS 分光光度计的更多应用1.6.1 蛋白和DNA 分析在其基本结构中，DNA 由两个脱氧核糖核酸长链组成，这两个脱氧核糖核酸链交结成一个双螺旋结构。
该链在基本组分为嘌呤和嘧啶(Pu-Py碱基，腺嘌呤和胸腺嘧啶(A-T及鸟嘌呤和胞嘧啶(G-C间用氢键连接起来，这些基本组分形成DNA 在UV 区的特征吸收，在260 nm处具有最大吸收峰。
测定既是在260 nm处测定吸收值和用Lambert-Beer 定律进行计算浓度。
图 8： DNA标准溶液在260nm 和280nm 处的特征吸收蛋白质是DNA 溶液中一种易被沾污的物质。
核酸的纯度可以通过测定260 nm 和280nm 的吸收值比值进行计算，如果该比值假设在1.8和2之间，则纯度为70% - 95%。
蛋白质在280nm 处有一个最大吸收，主要可归于氨基酸(尤其是色氨酸和酪氨酸的芳香环系统。
所以，蛋白质可以用Lambert-Beer 定律在280nm 处直接测定吸收值；蛋白质浓度的测定也可以通过使用生色试剂，比如Bradford 试剂（用考马斯亮兰G-250，最大吸收在595nm 处），缩二脲试剂（把从缩二脲试剂和组氨酸链环的氧原子间的Cu 2+化合物染成紫罗兰色，最大吸收值在546 nm处）和Lowry 试剂（缩二脲的联接、福林和钼蓝反应，最大吸收在540-750 nm之间。
1.6.2 DNA 熔点测定DNA 双螺旋解链既是升温引起的熔化的过程。
这里的熔化温度Tm 是双螺旋结构解链了一半的温度。
碱基对的分离结果（增色变化），随着温度的提高，在260 nm处的吸收增加。
为了测定温度-吸收值对应的可能产生的变化，需要非常精确地控制温度。
帕尔帖温度控制精度可以到达0.1℃，比常规的水浴温度控制更好。
熔点曲线可以用光谱中的任何波长进行计算光谱。
图 9：不同温度下的DNA 光谱图 10：DNA 在260nm 处的熔点曲线例如，Tm 值可以在测定熔点曲线的曲线图上查到。
该熔点温度取决于当时的碱基对。
具有高比例GC 对的DNA 显示出比AT 碱基对较多的DNA 更高的Tm 值。
57.7℃的Tm 值是DNA 用于诊断小牛斑疹伤寒病的实例。
1.7 导数光谱导数光谱包括对用于定性和定量测定的光谱进行求导。
紫外和可见波长范围内，许多非常重要的样品的定性和定量分析是应用导数光谱才能完成的。
导数光谱精细结构中的准确信息可在解析重叠光谱时认定化合物。
导数光谱也已成为用于光谱干涉对待测物影响的研究。
通过获取光谱的导数，可以抑制背景信号在测定光谱上的重叠，且更有效地加强吸收系数。
用UV VIS分光光度计进行Lambert-Beer 定律的下列导数：输出光谱（公式 3）1阶导数公式 42阶导数公式 53阶导数公式64阶导数公式 7导数可以设为正值和负值，因为第一导数和第二导数在吸收光谱的斜坡中每一个变化都是非常灵敏的，导数光谱法是适用于分析重叠吸收光谱的很好的方法。
为此，导数光谱常被用于分析工作的微量测定，也就是定量测定。
切线、波峰-波峰和波峰-波谷法等都可用于计算。
1.7.1 色度分析颜色是物质的重要特性。
颜色可以通过计算固体或不透明样品的反射光谱测定，也可以通过测量半透明样品，例如树脂、石油及清洁剂等的透射获得。
图 11：肉眼看到的颜色肉眼看见的各种颜色和其被吸收的补色。
例如，黄色溶液吸收蓝色范围内的光，如下表所示。
吸收色紫罗兰色蓝色绿蓝色绿色黄绿色橙色红色吸收波长[nm] 380 – 435 435 – 480 480 – 490 490 – 560 560 – 595 595 – 650 650 - 780补色黄绿色黄色橙色红色紫色绿蓝色蓝绿色肉眼的视觉过程是带有标准数据的数学模型，其结果是一整套客观且独特的描述样品颜色的色值。