实验二细菌的普通染色和革兰氏染色
一、实验目的
1．掌握细菌涂片标本的制备方法和普通染色的步骤；
2．掌握革兰氏染色法的步骤和关键点；
3．识别细菌的革兰氏染色结果；
4．学习无菌操作技术。
二、实验原理
一般认为革兰阳性细菌的肽聚糖层较厚，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩小，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色；而革兰阴性细菌的肽聚糖层很薄，脂肪含量高，经乙醇处理后部份细胞壁可能被溶解并改变其组织状态，细胞壁孔径大，不能阻止溶剂透入，因而将结晶紫与碘的复合物洗去而被脱色。
虽然如此，革兰染色的差异并不能完全认为是化学的差别，也有物理结构不同的结果，因为酵母菌细胞壁的成份完全和细菌不同，但具有革兰染色阳性反应。
三、实验器材
载玻片，盖玻片，接种环，酒精灯，显微镜、擦镜纸、镜油、擦镜液；
结晶紫、革氏碘染液、95%酒精、番红染液；
枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和未知菌的18小时的液体培养液，酵母菌平板，大肠杆菌平板，牙垢。
四、实验步骤
1、涂片
左手持菌液EP管，右手持接种环，在火上对接种环灭菌后，从EP管中取一环培养液，于载玻片中央涂成薄层（事先在背面做好标记圆圈），将接种环在火焰上烧灼灭菌。
若是从平板上取材，则事先在载玻片上滴一小滴水，在火焰附近把平板打开一小口，用接种环调取菌落边缘的物质涂于水滴上。
室温下自然干燥。
2、固定
手持或镊子夹载玻片一端，标本面朝上，在灯的火焰外侧快速来回移动3~4次，共约3~4秒。
要求玻片温度不超过60℃，以玻片背面触及手背皮肤不觉过烫为宜，放置待冷后染色。
3、初染
滴加1滴草酸铵结晶紫染液，染色1分钟，水洗，吸干。
4、媒染
用碘液冲去残留水，再加1滴碘液覆盖涂片1分钟，水洗，吸干。
5、脱色
用吸水纸吸去玻片上的残留水，滴加95%的乙醇脱色，轻轻摇动玻片，倒掉脱色液，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗，吸干。
脱色时间20~30秒。
6、复染
滴加1滴蕃红染液复染1-3分钟以上，水洗。
7、镜检照相
吸干载玻片背面及标本周围水渍,滴上半滴水，盖上盖玻片,油镜镜检；看到合适的结果后拿着标本到4楼实验室显微摄影。
五、实验结果
6张装片的实验结果见表1，照片见图1。
表1 . 各菌种的染色结果及形态特征
菌名形态特征染色结果结论
枯草芽孢杆菌个体较大，呈杆状，
多见成对短链状
红色，G－假阴性
金黄色葡萄球菌个体小，球状，成团
存在
紫色，G＋符合理论
大肠杆菌个体小，短棒状，分
散存在
红色，G－符合理论
未知菌个体小，球状，分散
存在
紫色，G＋未知菌为G＋菌
酵母个体巨大，卵状，成
团存在
紫色，G＋符合理论
牙垢个体小，球状，成团
存在，杂质较多紫色，G＋牙垢中基本上为G＋
菌
（a）枯草芽孢杆菌，10×100倍放大
（b）金黄色葡萄球菌，10×100倍放大（c）大肠杆菌，10×100倍放大
(d)未知菌，10×100倍放大
（e）酵母，10×100倍放大
（f）牙垢，10×100倍放大
图1. 微生物革兰氏染色显微照片
六、讨论
1．涂片时的干燥
在涂片时，如果是直接调菌液，则用接种环一蘸即可，如果是从平板菌落上取样，事先滴水时千万不要滴太大的液滴，总之是为了使涂片尽快干燥。
如果不慎水加多了，不能用吸水纸吸，因为此时还没有固定，会将大部分细菌吸走。
可考虑放到酒精灯上方较远处，微热干燥，以手心能感到温暖为宜。
不能太低，会对细菌造成杀伤。
2．固定
本次实验中较难掌握度的一步。
在火焰上方约10cm处来回过3～4次即可。
固定不充分的话后续清洗时会将细菌洗掉，固定过热的话又将细菌烧焦，不能上色。
需要注意的是，热固定会改变细菌的内部结构和外形，若研究菌体细胞结构时还是要用化
学固定法。
3．脱色时间
最难掌握度的一步！脱色时，最初洗下的酒精都看不出初染的蓝色，也就无法判断脱色是否充分，所以只能通过多次实验，建立洗脱时间梯度来逐步摸索。
我们的金黄色葡萄球菌做了3次才得到勉强理想的染色结果。
个人觉得用不了书上说的30s，洗2次大约15s就足够了。
基础实验，我们可以根据已知的菌种知识来调节洗脱时间，比如G＋就洗短点，G－就洗长点，但是对于以后的未知菌种，这样做是不可以而且不可能的！所以一定要在基础试验中打下扎实的革兰氏染色操作基础，标准化动作，以后才能对未知菌种做出正确鉴定。
4．大肠杆菌的复染
老师事先提醒过大肠杆菌不好染色，复染可延长时间。
我们复染5分钟后镜检，发现染色效果不理想，于是小心地拆下盖玻片不使镜油污染样品，再次滴加蕃红染色5分钟，累计10分钟复染。
第二次镜检的结果就好多了。
说明我们的补救方法是可行的。
另外，我们对面是几位重做实验的同学，助教为他们准备了大肠杆菌平板。
一开始我们误将此板当作酵母，根本没考虑二者菌落外形的巨大差异，制片后一致在困惑酵母怎么这么小而且是阴性的（我们居然分不清菌落特征却还记得分清细菌个体），重复制片结果仍然如此！苦恼中求助助教，才发现取错样品了。
拿到酵母平板后，惊叹于二者菌落外形差异如此巨大我们却没有注意到，看来上次课观察平板写完报告后就忽略了。
这提醒我们即使是基础教学试验这种材料很固定的实验也要小心，自己要有判断能力，而且千万不能忘了前面的成果。
值得一提的是，我们一共做了3块大肠杆菌片子（2固1液），染色都很不错，有的同学却染了一下午才得到理想结果。
我们可谓“无心插柳柳成荫”了。
这同时也说明，平板比液体培养基适于做染色实验。
5．染色结果
这次报告中唯一不理想的染色是枯草芽孢杆菌，是我同组制作的。
但是这张片子我当时看过，的的确确是紫色！这是我们第一张片子，照相前非常谨慎，请教助教鉴定后才决定拍照的，不知道为什么在数字摄影的成像系统下就失真了。
肉眼观察可是千真万确的阳性结果啊……本想像以前处理实验结果一样PS一下，突然意识到这次是染色实验，看的就是颜色结果，PS就毫无意义了。
所以只好忍了，暂且算作假阴性吧。
这再次说明，摄影技术发达的今天，肉眼仍然是不可替代的。
6．酵母菌能进行染色吗？结果如何？为什么？
能，显革兰氏阳性结果。
酵母的细胞壁不含肽聚糖，主要成分是葡聚糖、甘露聚糖，还有几丁质等，它们都是多糖的复杂分支聚合物，不溶于乙醇，且酵母细胞壁脂类较少，因此在媒染后，结晶紫-碘复合物不易脱出细胞壁，故呈现革兰氏阳性反应。
七、思考题
1．牙垢里大概能看到几类菌，哪几种较多？
我的样品中几乎全是革兰氏阳性球菌。
通过网上查资料可知：牙垢是在牙齿表面逐渐沉积的生物薄膜，由食物残渣、脱落的口腔上皮细胞、唾液和细菌构成，其中细菌主要是正常口腔内存在的链球菌、厌氧菌等。
这与我们的实验结果相符，也解释了为什么有的组的样品中含有细胞状物体和固体颗粒，那是口腔上皮细胞和食物残渣。
建议以后做此实验前刷牙或漱口，减少杂质对观察细菌的干扰。
2．酵母菌能进行染色吗？结果如何？为什么？
能，显革兰氏阳性结果。
酵母的细胞壁不含肽聚糖，主要成分是葡聚糖、甘露聚
糖，还有几丁质等，它们都是多糖的复杂分支聚合物，不溶于乙醇，且酵母细胞壁脂类较少，因此在媒染后，结晶紫-碘复合物不易脱出细胞壁，故呈现革兰氏阳性反应。
八、参考文献
1．陈金春，陈国强，微生物学实验指导，清华大学出版社，2005；
2．诸葛健，工业微生物实验与研究技术，科学出版社，2007；
3．百度百科，。