内源酶造成的着色
巨噬细胞吞噬各种抗原物质或 Fc 片断而出现胞浆着色 内源性生物素的着色
组织在缓冲液（如二甲苯）中 浸泡时间太长 组织变干 不适当的修复方式
较多的切片 如果制片过程中，因丙酮逐渐 挥发而胶变浓时可适当加入一 些丙酮。 加一抗前的血清封闭避免非特 异型的结合
将抗体分装在小管中，冻存于 -20 度，每次使用取一管，避 免抗体反复冻融及交叉污染。 可用过氧化氢封闭去除内源酶 导致的非特异性着色 通过形态学辨认出巨噬细胞
余的缓冲液（但防止切片干燥）
孵育时切片未放平，导致抗体 孵育时，注意切片应水平放置
流失
蛋白封闭过度
封闭时间不要超过 10 分钟
不适当的标本固定方式
选择合适的固定方法
不适当的抗原修复方式
延长抗原修复时间，或者调整
抗原修复体系，建议参照生产
厂家的说明，同时结合标本的
具体情况来确定
抗体浓度过高
降低抗体滴度（一般只浓缩性
3. 非 特异 性背 景染 色
全片着色
切片边缘着色
“阴阳脸”着色 灶片状着色
少于 60 分钟
抗体孵育时间过短
抗体孵育时间不能少于 60 分
钟
标本中目的蛋白表达量低
查阅文献或数据库，确定组织
中确有目的蛋白强表达。设立
阳性对照片，以验证实验结果
操作中，切片遗留太多冲洗液， 每步滴加试剂前沥干切片中多
导致试剂稀释
免疫组织化学常见问题和解决方法
免疫组织化学技术又称免疫细胞化学技术，是指用标记的特异性抗体在组 织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、 定位、定量测定的一项免疫检测方法。它把免疫反应的特异性、组织化学的可 见性和分子生物技术的敏感性等巧妙结合，借助显微镜的显像和放大作用，在 细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质（如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以 及受体等），是单一的静止的形态学描述，上升到结构、功能和代谢为一体的动 态观察，为疾病的诊断、鉴别诊断和发病机制的研究提供了强有力的手段。
热抗原修复暴露的内源性生物 素可被鸡蛋清封闭，非生物素 检 测 系 统 Polymer 两 步 法 （EliVision、EnVision）可避 免生物素干扰。 控制组织在缓冲液中浸泡的时 间 修复液溢出后未及时补加液体 调整修复液 PH 值，修复时间及 修复方案
时试剂渗入后不易洗尽而局部 倾斜 45 度放置，利于水分流走
显色过深
和蒸发
切片有坏死组织
选择切片时避免选择坏死组织
间质着色 细胞浆着色 细胞核着色
制作 APES 胶片时，胶的浓度太 高导致显色时出现白色小点着 色 抗体与组织中的蛋白质因蛋白 疏水基团相互作用形成非特异 性的连接而着色 抗体不纯或者抗体被污染
组织，边缘的试剂容易首先变 组织边缘 2 mm。
干，浓度较中心组织高而致染
色深
试剂仅覆盖部分组织而非全部 滴加试剂后，不平，部分组织未被染 注意保持染色盒水平放置
色剂覆盖
有气泡，将试剂推到周围而部 有气泡是需用牙签捅破
分组织不着色
切片中气泡是组织突起，染色 去除漂盒里的气泡，晾片时应
然而，要想得到一张高质量的免疫组化染色切片也并非易事。由于切片制 作和免疫组化染色过程均存在很多步骤或环节，每一个步骤或环节都需要操作 者严格控制实验条件，否则可能会影响到最终结果。现就试验中遇到得常见问 题进行分析总结，给进一步给出解决方案，希望能为帮助相关实验人员提供实 验成功率。
表 1.免疫组织化学实验中的常见问题及其解决方法
抗体）抗体。
抗体孵育时间过长
严格执行操作规程，最好使用
定时器及时提醒，避免造成时
间延长。
孵育温度过高，孵育温度超过 建议控制在 4 度
37 度
显色时间过长或显色剂浓度过 显色时间不能超过 5-10 分钟，
高
如果条件允许，最好能在显微
镜下监控，达到理想的染色程
度时立即终止反应。
组织变干
修复液溢出后未及时补加液体
抗体变质
注意抗体有效期，使用效期内
抗体。
组织边缘与玻片黏贴不牢，组 组织切边尽量薄，不厚于 4 微
织下试剂无法清洗干净
米；
避免选用坏死较多的组织
试剂未充分覆盖组织，边缘的 试剂要充分覆盖组织，应超出
试剂容易首先变干，浓度较中 组织边缘 2 mm。
心组织高而致染色深
切片上滴加的试剂未充分覆盖 试剂要充分覆盖组织，应超出
出现的问题 1.染色阴性
2.染色弱
可能的原因 试剂失效 漏加试剂 试剂加入顺序颠倒 组织中无目的抗原表达或表达 量太低 一抗与二抗种属不匹配
抗体不足 组织未进行抗原修复 在固定和包埋过程中，抗原变 形导致表位变化 冲洗液与反应试剂不匹配
抗体浓度过低
处理方法 重新试验，设立阳性对照
查阅文献或数据库，确定组织 中确有目的蛋白强表达。设立 阳性对照片，以验证实验结果 仔细确定一抗与二抗种属无 误，如果一抗来源于兔，则二 抗需选择抗兔二抗， 了解一抗的类型，如果一抗是 小鼠 IgG1，那么二抗应选择抗 小鼠 IgG1。 提供抗体量，延长孵育时间， 如 4 度反应过夜。 有些组织需要经过抗原修复才 能检测抗原表达 采用多种抗原恢复方法 包埋是控制温度在 58 度或低 于 58 度 调整溶液 PH 值，注意过氧化物 酶底物匹配的溶液中不应含有 叠氮钠 提高抗体浓度，孵育时间不能