参考文献
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[2] 吴阶平， 吴阶平泌尿外科学，山东科学技术出版社，2004.5：898-917 二、研究内容和技术关键 研究的总体目标： (1) 研究 PEDF 表达与膀胱癌的发生、分期、分级、转移及预后的关系，探讨 PEDF 表达在膀胱癌发 生、发展及转移过程中可能的作用机制。 (2) 研究 PEDF 对膀胱癌细胞的治疗效果，为临床治疗膀胱癌的生物治疗探索一种新的有效方法 研究的创新点： 本课题研究的内容和思路不同于以往的其他研究，应用分子生物学方法从研究 PEDF 表达与膀胱癌的发 生、分期、分级、转移及预后的关系入手，探讨 PEDF 表达在膀胱癌发生、发展和转移中可能的作用机制。 在此基础上，以连接有 PEDF 编码基因的腺病毒载体转染膀胱癌细胞株、以 PEDF 蛋白治疗裸鼠膀胱癌模 型，探讨 PEDF 对膀胱癌的治疗作用。目前，本项研究国内、外尚未见报道。本研究的顺利完成，将为膀胱 癌的生物学行为的研究开辟了新的途径，也将为膀胱癌的生物学治疗探索一种新的有效方法。
近来研究发现，色素上皮衍生因子（pigment epithelium derived factor, PEDF）是一种对肿瘤有抑制作 用的细胞因子。这种细胞因子是 Tombran-Tink 等在实验中发现的，由人视网膜色素上皮细胞分泌的一种
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以人膀胱癌细胞种植于裸鼠皮下，建立裸鼠膀胱癌模型。以 PEDF 蛋白（购自吉泰生物科技有限 公司）直接注射于裸鼠皮下肿瘤组织内作为治疗组，以未注射 PEDF 组为阴性对照组。观察各组的 MVD、VEGF 及肿瘤增殖情况，探讨 PEDF 表达在膀胱癌发生、发展中的作用机制，评估 PEDF 对膀胱癌 的治疗效果，为进一步过度到临床应用提供依据。
膀胱癌是危及人类健康的重大疾病，全世界范围内统计其发病率占全身肿瘤的第 8 位，在男性其标 准发病率 9.9/10 万；在女性，其标准发病率为 2.3/10 万，占第 25 位。死亡率在男性为 4.2/10 万，占全身肿 瘤死亡率的第 9 位，在女性为 1.1/10 万，占第 16 位。在我国,膀胱癌也是泌尿外科的最常见恶性肿瘤，占 全身恶性肿瘤的 3.2%，1995 年，北京市城区膀胱癌发病率大约为 7/10 万人，上海市城区发病率为 8.6/10 万人[1]，且今后发病率仍有上升趋势。作为危害人类健康的常见恶性肿瘤，膀胱癌发病机制和治疗方面的 研究始终是临床基础研究的重点之一。
蛋白质，分子量为 50 KD[5]，属于 serpin 卵白蛋白/PAT-2 亚群，其基因全长 16 kb，位于染色体 17p13.1pter [6] 。
多项研究表明，PEDF 是一种天然的高效的新生血管抑制剂[7]，并通过诱导肿瘤细胞分化起到抑 制肿瘤生长的作用。Tombran-Tink 等将 PEDF 基因定位于染色体 17p13.1,肿瘤发生与该区域关系密切，提 示该基因可能是抑癌基因或肿瘤相关基因[5]。对肿瘤细胞进行编码 PEDF 的腺病毒转染，在血管内皮生 长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）存在的情况下，PEDF 明显阻止了血管内皮细胞管腔形 成和迁移。对患有 CNV/AMD 患者的体外实验也发现，PEDF 大量减少的情况下，内皮细胞有明显迁移;而 对照组含有正常水平 PEDF,则抑制了内皮细胞的迁移[6]。Crawford 等发现 PEDF 在神经母细胞瘤中是肿 瘤细胞分化调控的主要的抗血管生成的抑制剂[7] 。肝癌患者血管增生和肿瘤发展中，PEDF 作为 VEGF 的拮抗因子，起到了抑制作用。对裸小鼠的在体实验以及鼠的肺癌模型也同样证明了 PEDF 对肿瘤的抑制 作用。其机制乃因 PEDF 减少肿瘤微血管的密度，因而可被用于抑制肿瘤新生血管形成，从而抑制肿瘤的 生长，在肿瘤的治疗前景上非常乐观[8]。
①① Western blot 法检测 VEGF、TSP-1、MMP-9。 ①① ELISA 法检测 TNF-α、IL-1α、血栓调节蛋白、IL-8 浓度。 ①① 免疫组化方法检测标本 MVD。 ①① 整理临床资料：
膀胱癌患者性别、年龄、组织病理、分期、分级、是否转移、5 年生存率。
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研究方法： 方法（1）膀胱癌组织和非癌膀胱组织中 PEDF 和相关细胞因子表达的检测及相关性研究：
实验组
对照组
膀胱癌组织
标本
B期
A期
C期 D期
非癌膀胱组织
癌旁膀胱组 织
正常膀胱组 炎性膀胱组
织
织
例数 30
30
30 30
120
120
120பைடு நூலகம்
①① 应用 SYBR Green I 实时定量聚合酶链反应（real-time PCR）技术,对膀胱癌、非癌膀胱组织中 PEDF 进行定量测定。
染为对照。 ①① Western blot 法检测 VEGF、TSP-1、MMP-9 表达。 ①① 观察膀胱癌细胞增殖、侵袭、凋亡情况。 ①① 统计分析。
方法（3）PEDF 对裸鼠膀胱癌模型的治疗： 以人膀胱癌细胞种植于裸鼠皮下，建立裸鼠膀胱癌模型。以 PEDF 蛋白直接注射于裸鼠皮下肿瘤内作
为治疗组，以未注射 PEDF 为阴性对照组。观察两组膀胱癌组织 MVD、VEGF 表达情况、肿瘤增殖情况，评价 PEDF 对膀胱癌的治疗效果。 ①① 以人膀胱癌细胞种植于裸鼠皮下构建膀胱癌裸鼠模型。 ①① 将 PEDF 蛋白注射于裸鼠瘤体内。 ①① 应用免疫组化方法检测 MVD；应用 Western blot 法检测 VEGF、TSP-1、MMP-9；观察肿瘤增殖、凋亡情
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色素上皮衍生因子（PEDF）在膀胱癌中的表达 及其对膀胱癌治疗作用的研究
一、趋势判断和需求分析 国内外现状、水平和发展趋势（含知识产权状况和技术标准状况）；经济建 设和社会发展需求；科学技术价值、特色和创新点。
(2) PEDF 对膀胱癌细胞株的治疗： 以连接有 PEDF 编码基因的腺病毒载体转染膀胱癌细胞株,以空载转染膀胱癌细胞株作为对照，
观察检测 VEGF、TNF-α 的表达情况及膀胱癌细胞的凋亡、增殖情况。 (3) PEDF 对裸鼠膀胱癌模型的治疗：
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在膀胱癌的这些辅助性治疗方法中，无论是化疗还是免疫治疗，主要机制是通过直接杀死肿瘤细胞、 阻断肿瘤细胞分裂或诱导细胞调亡的方式来抑制肿瘤生长。做为一种实体性肿瘤生长，肿瘤细胞的增殖固 然重要，而新生血管的形成在肿瘤的生长和复发、转移过程中也发挥非常重要作用。在正常状态下，人体 内的脉管系统在血管生长因子和抑制因子网络式的相互作用下处于平衡状态；病理状态下，尤其是发生恶 性肿瘤时，这种平衡向血管生成的方向发展。当肿瘤生长达到肿瘤组织超过 2mm 时就会有新生血管形成， 如果没有新生血管生成，肿瘤生长明显受到抑制，甚至停止[2，3]。抗血管生成疗法是不同于目前常规疗法 的新的肿瘤治疗策略，具有高效低毒和不易产生耐药性的特点[4]。有关血管生长因子和血管生长抑制因 子在肿瘤中所起作用，以及通过抗血管生成治疗肿瘤已经成为当前肿瘤研究的一个热点。
方法（2）PEDF 对膀胱癌细胞株的治疗： 以连接有 PEDF 编码基因的腺病毒载体转染膀胱癌细胞,以空载转染膀胱癌细胞作为对照，检测
VEGF、TNF-α 浓度，观察细胞的增殖、凋亡情况，分析相关性。 ①① 以 RT- PCR 法扩增 PEDF 基因。 ①① 将扩增后的 PEDF 基因连接入腺病毒载体，转染膀胱癌细胞。并以空载转
目前膀胱癌的治疗仍以手术切除为主，辅以膀胱灌注化疗和免疫治疗、全身化疗、放疗和生物治 疗等措施, 但这些治疗方法效果都不满意，主要是治疗后易复发，复发率高达 80%，其中大约 16%-25%复 发的肿瘤其恶性程度增加，有 10%发展为浸润性或转移性癌，因此,寻找一种新的、更有效的生物治疗方法， 是当前临床迫切需要解决的问题。
我们最近对 PEDF 在膀胱癌中表达情况的初步研究发现，PEDF 在膀胱癌组织中表达明显低于正常 膀胱组织，而且 PEDF 表达情况与膀胱癌的恶性程度以及癌组织中微血管密度呈负相关，提示 PEDF 在膀 胱癌的发生、发展中具有一定的作用，PEDF 的正常表达可能抑制膀胱癌细胞的生长、增殖，PEDF 有可能 成为膀胱癌生物学治疗的一种有效的新方法。目前国内、外尚未见此项研究的相关报道。因此我们设想， 扩大样本量，应用分子生物学技术检测膀胱癌组织及非癌膀胱组织中 PEDF 的表达水平，进一步研究 PEDF 在膀胱癌中的表达情况，并结合临床资料分析 PEDF 表达与膀胱癌分期、分级、转移及预后的关系； 通过研究膀胱癌组织中 PEDF 与 VEGF 表达的相关性，PEDF 与血小板反应素-1 表达的相关性，探讨膀癌 组织中 PEDF 表达与肿瘤血管形成的相关性及可能的作用机制；通过研究 PEDF 表达与金属蛋白酶9（MMP-9）的相关性，探讨 PEDF 表达与膀胱癌浸润的相关性；通过研究 PEDF 表达与已知的对肿瘤生长 有明确调节作用的肿瘤坏死因子 α（TNF-α）、白细胞介素 1α（IL-1α）、血栓调节蛋白（thrombomodulin）和白 介素 8（IL-8）等细胞因子表达的相关性，探讨 PEDF 表达对膀癌细胞调节的可能机制，从而探讨 PEDF 在 膀胱癌发生、发展过程中的可能作用机制；在此基础上，以连接有 PEDF 编码基因的腺病毒载体转染膀胱 癌细胞株、以 PEDF 蛋白治疗裸鼠膀胱癌模型，进一步探讨 PEDF 表达对膀胱癌细胞生长的抑制作用以及 对膀胱癌的治疗效果,为膀胱癌的生物学治疗探索一种有效的新方法。