普通光学显微镜的使用及微生物形态观察与革兰氏染色法
胡雪芳 201300261033
【实验目的】
1.学习显微镜的结构、各部分功能和使用方法
2.学习细菌制片方法
3.学习细菌染色原理和方法
4.巩固无菌操作技术
5.学习图像结果的规范表示
【实验原理】
1.显微镜的结构和各部分功能
现代普通光学显微镜
利用目镜和物镜两组透
镜系统来放大成像，故又
常被称为复式显微镜。

它
们由机械装置和光学系
统两大部分组成。

在显微
镜的光学系统中，物镜的
性能最为关键，它直接影
响着显微镜的分辨率。

而
在普通光学显微镜常配
置的几种物镜中，油镜的图1. 显微镜的构造放大倍数最大，对微生
物的研究最为重要，与其他物镜相比，油镜的使用方法比较特殊，需要在载玻片和镜头之间加滴镜油，这主要有如下两方面的原因：1.1增加照明亮度
油镜的放大倍数可达100x，放大倍数这样大的镜头，焦距很短，直径很小，但所需要的光照度却很大。

而从显微镜的结构看，从承载标本的玻片透过来的光线，因介质密度不同（从玻片进入空气，再进入镜头）有些光线会因折射或全反射，不能进入镜头，致使在使用油镜时，会因为射入的光线较少，物像显现不清。

所以为了不使通过的光线有所损失，在使用油镜时须在油镜与玻片之间加入与玻璃的折射率（n=1.55）相仿的镜油（通常用香柏油，其折射率为1.52）。

1.2增加显微镜的分辨率
显微镜的分辨率和分辨力是指显微镜能辨别两点之间最小距离的能力。

最小可分辨距离越小，分辨率越高。

从物理学角度来看，光学显微镜的最小可分辨距离受光的干涉现象及所用物镜性能的限制，可表示为：
最小可分辨距离=
λ2NA
式中：λ为光源光波长，NA为物镜的数值孔径值。

光学显微镜的光源不可能超出可见光的波长范围（0.4~0.7μm），而数值孔径值取决于物镜的镜口角和玻片与物镜间介质的折射率，可表示为：
NA=n*sinɵ
式中：ɵ为物镜镜口角的半数，它取决于物镜的直径和工作距
离，一般来说在实际应用中物镜镜口角最大只能达到120°。

而n为介质折射率，由于香柏油的折射率（1.52）比空气和水
（分别为1.0和1.33）要高，因此以香柏油作为镜头与玻片之间介
质的油镜所能达到的数值孔径值（NA一般在1.2~1.4）要高于低倍镜、高倍镜等（NA都低于1.0）。

若以可见光的平均波长0.55μm来计算，数值孔径通常在0.65左右的高倍镜只能分辨出距离不小于0.4μm的物体，而油镜的分辨率却可达到0.2μm左右。

2.细菌染色——碱性染料
革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料初染液；媒染剂；脱色剂和复染液。

碱性染料初染液的作用与在细菌的单染色法基本原理中相同，用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫。

媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘（iodine）是常用的媒染剂。

脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95%的酒精（ethanol）。

复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液是番红。

3.细菌细胞壁结构与革兰氏染色
革兰氏染色法可将细菌分成革兰氏阳性和革兰氏阴性两种类型，这是由这两种细菌细胞壁结构和组成的差异决定的。

首先利用草酸铵结晶紫初染，所有细菌都会着上结晶紫的蓝紫色，然后利用卢戈氏碘液
作为媒染剂处理，由于碘与结晶紫形成碘-结晶紫复合物，增强了染料在菌体中的滞留能力。

之后用95%乙醇作为脱色剂进行处理时，两种细菌的脱色效果不同。

革兰氏阳性细菌细胞壁肽聚糖含量高，壁厚，且脂质含量低，肽聚糖本身并不结合染料，但其所具有的网孔结构可以滞留碘-结晶紫复合物，现在一般认为乙醇处理可以使肽聚糖网孔收缩而使碘-结晶紫复合物滞留在细胞壁，菌体保持原有的蓝紫色。

而革兰氏阴性细菌细胞壁肽聚糖含量低，交联度低，壁薄且脂质含量高，乙醇处理时脂质溶解，细胞壁通透性增加，原先滞留在细胞壁中的碘-结晶紫复合物容易被洗脱下来，菌体变为无色，用复染剂（如番红）染色后又变为复染剂颜色（红色）。

A B
图2.革兰氏阴性菌和革兰氏阴性菌细胞壁组成
【实验材料】
1.染液
碱性染料初染液：结晶紫
媒染剂：碘液
脱色剂：酒精
复染液：番红
2.菌株
2组1套菌株：即没株菌5支。

37度12-14小时。

3.酒精灯、接种环、载玻片、香柏油、普通光学显微镜等。

【实验步骤】
1.单染色
制片（具体步骤同革兰氏染色制片），然后滴加染液（结晶紫或者番红染料）覆盖于菌膜处1-2min，倾去染液后水洗至无色，用滤纸吸去多于水分，干燥，观察。

2.革兰氏染色
1.1制片
取活跃生长期大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和未知菌种在载玻片的左侧、右侧和中间部分按常规方法涂片（不宜过厚）、干燥和固定。

1.2初染
滴加草酸铵结晶紫染液覆盖涂菌部位，染色1~2min后倾去染液，
水洗至流出水无色。

1.3媒染
先用卢戈氏碘液冲去残留水迹，再用碘液覆盖1min，倾去碘液，水洗至流出水无色。

1.4脱色
将玻片上残留水用吸水纸吸去，在白色背景下用滴管滴加95%乙醇脱色（一般20~30s），当流出液无色时立即用水洗去乙醇。

1.5复染
将玻片上残留水用吸水纸吸去，用番红复染液染色2min，水洗，吸去残水晾干。

1.6镜检
油镜观察。

【实验结果】
1.单染色结果
单染色菌株是未知菌株，是球状菌，菌落是圆形的，结果见下页。

2.革兰氏染色结果
金黄色葡萄球菌为球状菌，有芽孢，中间透明。

大肠杆菌是杆状菌，X菌株是杆状菌，有芽孢。

被染成蓝紫色，是革兰氏阳性菌。

具体结果见图片。

【分析与讨论】
1.应该选择活跃生长期的菌种染色，老龄的革兰氏阳性细菌会被染
成红色而造成假阴性。

2.涂片不宜过厚，否则可能会因脱色不完全造成假阳性。

3.脱色是革兰氏染色是否成功的关键，脱色不够造成假阳性，脱色过
度造成假阴性。