缺点：条件要求高，必须要有细胞培养的 条件。
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2. 鸡胚接种
鸡胚是用于分离粘病毒科、疱疹病毒、痘 类病毒的较为理想的材料。
（1） 常用接种部位和用途
卵黄囊接种
38-39℃羊水腔接种
新鲜受精卵
5-13天
尿囊腔接种
绒毛尿囊膜接种
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气室 羊膜
羊水囊
卵壳
卵白
尿囊 绒毛尿 囊膜 卵黄囊
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① 卵黄囊接种：用于流行性脑炎病毒分 离
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2．标本种类的选择
根据临床感染的症状及流行病学资 料，判断可能感染病毒的种类，选择相 应部位采取标本，处理标本时要考虑病 毒的生物学特性。常见分离病毒标本的 选择见教材P64表4-2。 （1） 心脏疾病 （2） 中枢神经系统感染 （3） 先天或新生儿感染 （4） 胃肠道疾病 （5） 呼吸道感染
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8
（4） 粪便标本 取2~4g粪便标本在无菌的容器中，
加8~10ml运送液立即送检。
（5） 含漱液 可用无菌生理盐水，让患者含漱几
次取得，与运送液等量混合。
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（6） 喉拭子：用生理盐水湿润的拭子 采
取咽喉部表面，置运送液中，注 意
避免唾液污染。 （7）尿道拭子及尿液标本：尿道拭子伸
入尿道4cm轻轻转动2~3次，以 获
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病毒分离培养
病原学诊断 形态学检测
病
毒
核酸
学
检
验
分子生物学技术——病毒
补体结合试验 中和试验
血清学诊断 血凝抑制试验
间接免疫荧光检测
酶联免疫吸附试验
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一、标本采集与运送
（一）标本的采集 要从临床标本中成功地分离出病毒，很大
程度上取决于标本的恰当采样和处理，为了保 证标本质量，应注意以下问题：
1．采样时间 尽可能在发病的初期，急性期 或患者入院的当天进行，越早越好，最好在治 疗之前。疾病后期体内产生免疫力，病毒量减 少或消失。
2
病毒性疾病实验诊断的一般原则： 特异、敏感、快速和简便。首先根据流 行病学和临床特点，初步判断可能感染 的病毒；然后根据可疑病毒生物学特点、 机体免疫应答和临床过程，以及病人当 前所处的时机，确定实验诊断的方法。 目前病毒感染的检查主要依靠经典的方 法和近来发展起来的分子生物学等方法。 前者主要包括病毒分离培养、鉴定及血 清学实验；后者主要是核酸杂交与PCR 及现代免疫学技术。
病毒感染的实验诊断
张德纯 教授 临床微生物教研室
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病毒（Virus）是结构最简单、体积 最小的微生物。病毒感染十分常见，约 70%~80%的传染病由病毒感染所引起。 迄今已证实500多种病毒对人有致病性， 其中不少病毒危害极大，如最近流行的 SARS病毒。因此尽快获得病毒的实验诊 断，对控制病毒的传播、疾病的诊断和 防治具有重要的意义。
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为了抑制细菌生长通常在病毒传送培 养 基 （ VTM ） 中 加 入 抗 生 素 如 青 霉 素 100U/l 和 链 霉 素 100μ g/ml ， 为 了 抑 制 真菌的生长加入2.5μg/ml二性霉素B或 40μg/ml制霉菌素。
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二、病毒的分离与鉴定
（一）病毒分离和鉴定的一般程序 见书P66图4-1
② 羊水腔接种：用于流感病毒、副流感 病毒的初次分离
③ 尿囊腔接种：用于流感病毒、腺病毒、 腮腺炎病毒分离
④ 绒毛尿囊膜接种：用于痘病毒、疱疹 病毒分离
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（2） 鸡胚接种的特点 优点：A.鸡胚是一个整体，可有多种
接种途径； B.可收获大量病毒； C.鸡胚本是无菌无病毒的，对
接种病毒不产生抗体； D.来源广，操作简便。 缺点: A.易感病毒较少，应用较局限； B.反复用鸡胚传代，病毒毒力
离体的新鲜组织或器官，机械处理
胰蛋白
酶消化 液
பைடு நூலகம்
洗涤
加入营养液
吹打
单个细胞悬
1-3次
细胞计数 、调整细胞浓度
分装在培养
生长
瓶内培养 养
形成单层细胞，称为原代细胞培 15
胰酶消化 单层
转种新的培养瓶
形成
细胞，称为次代细胞培养
2． 二倍体细胞株
原代细胞多次连续传代后仍保持二倍体染 色体特性（即含23对染色体），称之为二倍体 细胞。传代细胞寿命一般为40~50代，大多数 为成纤维细胞,如人胚肺细胞。广泛用于病毒分 离和疫苗制备。
（2） 组织培养的类型
A 器官培养：如气管、肠段。器官保存了原功
能，用于分离某些有器官特异性的病毒。
B 组织块培养：如肝组织块培养肝炎病毒。
C 细胞培养（单层细胞培养）：现广泛使用的
组织培养技术。
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（3）细胞培养的种类和方法
根据细胞的来源、染色体特性和传代次数的不 同可分为三类：
1． 原代和次代细胞培养
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3．传代细胞系 来源于肿瘤细胞或细胞株传代过程的变异
细胞。细胞增殖特征和染色体均类似于肿瘤细 胞。不宜用于疫苗的制备，常用于病毒的分离 和鉴定。 （4）组织培养的特点
优点：A．来源广；B．不受机体免疫因 素影响，个体差异小，敏感范围广；C．易于 观察病变；D．可用于病毒的分离、鉴定、疫 苗的制备；E．易管理，相对比较经济。
得较多的上皮细胞，取出后置运 送
液中。 （8）尸检标本：应在死亡后尽早采取， 10
（二）标本的运送和保存
标本采集后注意无菌、冷冻、保湿、 立即送检。
分离培养病毒的标本要尽快送到实验 室处理和接种。如不能及时送检，可在 4℃冷藏数小时，如需较长时间保存则应 置-70℃。放置在-20℃，病毒容易灭活， 冻存液中需加入甘油或二甲亚砜等作保 护，避免反复冻融使病毒灭活。
3．常见标本的采集方法
（1） 血液：以无菌手续抽取抗凝血10ml， 抗凝剂可选用100u/ml肝素钠。为了血 清学检查的需要，应抽取另一管5ml血液， 不抗凝送检。
（2） 脑脊液：以无菌手续抽取脑脊液 1~2ml，置无菌试管内，在冰浴中立 即送检。4℃可存放72h。
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（3）宫颈或阴道拭子
采取病灶部位分泌物，将拭子置运 送液中；如无病损部位，则清理宫颈口 粘液，将拭子伸入宫颈约1cm停留5秒以 上取出，置运送液中4℃冰浴立即送检。
（二）病毒的分离 病毒是专性细胞寄生，需要在活细
胞或动物体内才能得到分离。选择何种动 物或细胞来分离，应根据临床感染的症状 和流行病学资料，推测可能的病毒种类， 选择相对敏感的动物和细胞来分离标本中 的病毒。
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1.组织培养
（1） 概念
将人或动物离体的活组织或分散的活细 胞，在实验室的试管或培养基中，模拟体内的 生理条件使之生存和生长，称之为组织培养。