课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数1．研究培养基对微生物的选择作用。

2．进行微生物数量的测定。

一、研究思路1．筛选菌株尿素是一种重要的农业____肥，但不能直接被农作物吸收利用，只有当土壤中的细菌将尿素分解成____之后，才能被植物利用。

土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成______。

（1）实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于目的______生长的条件（包括营养、______、pH等），同时______或______其他微生物生长。

（2）选择培养基：在微生物学中，将允许________的微生物生长，同时______或______其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。

2．统计菌落数目（1）常用来统计样品中______数目的方法是________。

即当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的________。

通过统计平板上的________，就能推测出样品中大约含有多少活菌。

为了保证结果准确，一般选择菌落数在________的平板进行计数。

统计的菌落数往往比活菌的实际数目____。

这是因为当两个或多个细胞在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。

因此，统计结果一般用________来表示。

（2）____________也是测定微生物数量的常用方法。

（3）细菌的数目还可以通过______法来测定。

例如，测定饮用水中大肠杆菌的数目，可将________的水过滤后，将滤膜放到________培养基上培养，大肠杆菌的菌落呈现____色，可以根据培养基上________的数目，计算出水样中大肠杆菌的数量。

3．设置对照（1）设置对照的主要目的是排除实验组中__________对实验结果的影响，提高实验结果的________。

（2）对照实验是指除了________的条件以外，其他条件都______的实验，其作用是比照实验组，排除任何其他可能原因的干扰，证明确实是所测试的条件引起相应的结果。

二、实验设计实验设计包括对实验方案，所需仪器、材料，用具和药品，具体的________以及时间安排等的综合考虑和安排。

关于土壤中某样品细菌的分离与计数的实验操作步骤如下：1．土壤取样土壤中的微生物70%～90%是_____，绝大多数分布在距地表______ 的近____性土壤中。

2．样品的稀释样品的________将直接影响平板上生长的菌落数目。

通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在________之间、适于计数的平板。

测定土壤中细菌的数量，一般选用____________倍的稀释液进行平板培养。

第一次实验时，可将稀释范围放宽一点，以保证能从中选择出适于计数的平板。

3．微生物的培养与观察不同种类的微生物，往往需要不同的培养______和培养______。

细菌一般在30～37 ℃的温度下培养1～2 d，放线菌一般在25～28 ℃的温度下培养5～7 d，而霉菌一般在25～28 ℃的温度下培养3～4 d。

在菌落计数时，每隔24 h统计一次菌落数目。

选取____________时的记录作为结果，以防止因____________而导致遗漏菌落的数目。

一般来说，在一定的培养条件下（相同的培养基、温度及培养时间），同种微生物表现出稳定的菌落特征。

菌落的特征包括______________和______等方面。

思考：土壤有“微生物的天然培养基”之称，为什么？三、操作提示1．无菌操作2．做好标记3．制定计划四、对分离得到的分解尿素的细菌的鉴定1．在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的______将尿素分解成了____。

氨会使培养基的碱性______，pH______。

因此，可以通过检测培养基____的变化来判断该化学反应是否发生。

2．在以______为唯一氮源的培养基中加入______指示剂。

培养某种细菌后，如果pH 升高，指示剂将变____，说明该种细菌能够________。

答案：一、1.氮氨脲酶（1）菌株温度抑制阻止（2）特定种类抑制阻止2．（1）活菌稀释涂布平板法一个活菌菌落数30～300低菌落数（2）显微镜直接计数（3）滤膜已知体积伊红美蓝黑黑色菌落3．（1）非测试因素可信度（2）被测试相同二、实施步骤1．细菌3～8 cm中2．稀释程度30～300104、105、1063．温度时间菌落数目稳定培养时间不足形状、大小、隆起程度颜色思考：由于土壤具备了各种微生物生长所需的营养、水分、空气、酸碱度、渗透压和温度等条件，是微生物生活的良好环境。

四、1.脲酶氨增强升高pH2．尿素酚红红分解尿素选择培养基配制时可添加某种化学成分，这里的“添加”是在基本培养基的培养成分的基础上加入的。

配制固体培养基和半固体培养基时加入的琼脂是从红藻中提取的，其主要成分是水溶性多糖，在配制培养基中作为凝固剂。

2．选择培养基一般来说，选择培养基是在培养基中加入某种化学成分，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长。

如，加入青霉素可以抑制细菌、放线菌的生长，分离出酵母菌和霉菌；加入高浓度的食盐可抑制多种细菌的生长，但不影响金黄色葡萄球菌的生长，从而分离得到该菌。

培养基中的营养成分的缺少也可达到分离微生物的目的。

如培养基中缺乏氮源时，可以分离固氮微生物，因为非固氮微生物不能在此培养基上生存。

当培养基的某种营养成分为特定化学成分时，也具有分离效果。

如石油是唯一碳源时，可以抑制不能利用石油的微生物的生长，使能够利用石油的微生物生存，达到分离能消除石油污染的微生物的目的。

生物适应一定环境，环境对生物具有选择作用。

所以通过配制选择培养基、控制培养条件等均可以选择出目的微生物，如将培养基放在高温环境中培养只能得到耐高温的微生物。

原则上只有目的微生物才能在选择培养基上生长。

但实际上，微生物培养是一个非常复杂的问题，有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物生长繁殖，因此能够在选择培养基上生长的微生物是不是所需要的微生物，还需要进一步的验证。

3．显微镜直接计数法与稀释涂布平板法的比较显微镜直接计数法是利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法。

此法是将经过适当稀释的菌悬液放在血球计数板的载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数。

由于计数室的容积是一定的，所以可以根据在显微镜下观察到的微生物数目来换算成单位体积内的微生物总数目。

由于此法计得的是活菌和死菌的总和，故又称为总菌计数法。

此法的优点是直观、快速，但需要与血球计数板配套使用，且计数随机性大，所以对菌体数量不能做出较为宏观、全面的反映。

平板菌落计数法通常做梯度稀释，所以计数的线性范围大。

由于是菌悬液涂布，所以比较均匀，能较好地反映菌落的疏密程度，重复性、平行性好，是经典的计数方法。

但需要平板上长出菌落一段时间后才能计数，因此速度慢是最大的缺点。

4．在土壤中采集菌样的方法与要点由于在土壤中几乎可找到任何微生物，所以土壤往往是首选的采集目标。

土壤采样必须考虑以下几个问题：（1）土壤中有机物的含量：有机物含量高，土质较肥，一般在其中的微生物数量较多，反之微生物数量较少。

（2）采土的深度：土壤的深度不同，其通气、养分和水分的分布情况也不同。

表层的土壤直接受日光曝晒，故较干燥，微生物也不易大量繁殖。

在离地面5～20 cm处的土壤中，微生物含量最高。

（3）植被情况：植被的种类与微生物的分布有着密切的关系。

例如，在冬天灌水的水稻田土壤中，真菌分布得较多。

（4）采土的季节：以春秋两季为宜。

这时土壤中的养分、水分和温度都较适宜，微生物的数量也最多。

采土时尤其应注意土壤的含水量，水分过多会造成厌氧环境，不利于放线菌的生长繁殖。

真菌虽需要较高的相对湿度，但基质中的水分却不宜过多。

因此要避免在雨季采集土样。

此外，土壤的pH也应适当注意，细菌和放线菌在中性或微碱性土壤中居多，而真菌则在偏酸性的土壤中较丰富。

（5）采土方法：选择好适当地点后，用小铲子除去表土，取5～20 cm处的土样几十克，盛入事先灭过菌的防水纸袋内，并在上面记录采土时间、地点和植被等情况。

5．实验设计注意事项（1）设置重复组。

实验要有足够的次数，才能避免结果的偶然性，使结论更有说服力与准确性。

如该实验中，可在每个稀释度下设置3个选择培养基平板；计数时在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，求平均值。

这样也可以为实验是否成功提供参考，如重复组结果不一致，则意味着操作有误，需要重新实验。

（2）设置对照。

对照的设置也会增加实验结果的可信度和说服力。

如在该实验中，可在配制培养基时，准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基两种，牛肉膏蛋白胨培养基作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用，在相同的稀释度下，牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数应明显多于选择培养基的。

另外，要设置空白对照，即在培养基中不加土样，如果空白对照的培养基上没有菌落生长，则说明培养基没有被杂菌污染。

题型一选择培养基的特点与应用【例题1】（2009·上海高考）氯苯化合物是重要的有机化工原料，因其不易降解，会污染环境。

某研究小组依照下列实验方案（图1）筛选出能高效降解氯苯的微生物SP1菌。

培养基配方如下表。

图1（2）培养基配制时，灭菌与调pH的先后顺序是________________________________ ________________________________________________。

（3）从用途上来说，Ⅰ号培养基和Ⅱ号培养基分别属于________培养基和________培养基。

在Ⅱ号培养基中，为SP1菌提供氮源的成分是________。

（4）在营养缺乏或环境恶劣时，SP1的菌体会变成一个圆形的休眠体，这种休眠体被称为________。

（5）将SP1菌接种在含不同浓度氯苯的Ⅲ号培养液中培养，得到生长曲线（如图2）。

从图2可知，SP1菌在________培养条件下最早停止生长，其原因是____________________ _____________________________________________________________________________。

图2解析：（1）固体培养基必须含有适量的琼脂。

（2）配制培养基时应先调pH后灭菌。

（3）Ⅰ号培养基是为了获得更多的菌株，属于通用培养基，Ⅱ号培养基是为了选择出SP1菌株，属于选择培养基，Ⅱ号培养基成分中含N物质为硝酸铵，则应由它为SP1菌株提供氮源。

（4）在恶劣环境下一些菌体会形成芽孢休眠体，来度过不良环境。

（5）SP1菌株是以氯苯为碳源，当氯苯消耗尽菌株因缺少碳源而不能继续生存，故氯苯含量越少，SP1菌株越早停止生长。

答案：（1）琼脂（2）先调pH，后灭菌（3）通用选择硝酸铵（4）芽孢（5）20 mg·L－1氯苯碳源最早耗尽题型二测定细菌数量的原理与方法【例题2】用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确的是（）。