微生物实验室间比对试验结果分析[摘要] 目的通过微生物室间比对，评价其检测结果的准确性，从而带动微生物实验室的质量控制工作及检测能力的提高。

方法对2009-2011年发放的考核样品通过场景分析，依据《食品卫生微生物学检验》、《食品安全国家标准食品微生物学检验》等方法进行检测。

结果2009年比对样品中检出山夫登堡沙门菌和单核细胞增生李斯特菌；2010年比对样品中检出大肠埃希菌O157：H7和小肠结肠炎耶尔森菌；2011年比对样品中检出奇异变形杆菌和阪崎肠杆菌。

结论比对试验有助于实验室检测质量及检测能力的提高。

室间比对是实验室以外的组织和机构对其质量水准进行的评价,可以考察各实验室的检测能力和检验结果的准确性[1]。

2009-2011年，仪征市疾控中心连续3年参加了扬通徐镇泰五市联合开展的疾控机构实验室间比对，均获得了满意的结果，现将这3次微生物比对结果分析如下：1 材料与方法1.1 样本与要求3次比对试验分别由镇江、泰州及扬州市疾控中心牵头并组织实施，模拟场景描述：均为××年×月×日，某医院的肠道门诊在12或24h内陆续接收到腹泻患者若干名，临床表现：部分患者有发热、感冒、恶心呕吐症状，体温在38.0℃～39.0℃之间波动；患者主诉均在一天前参加宴席或聚餐。

当地疾控中心赴现场开展流行病学调查，初步认定是一起由食源性致病菌引起的食物中毒事件，同时采集就诊患者肛拭子送实验室进行检验。

比对试验提供的是1份半固体培养基保存的模拟肛拭子样品，样品需要室温保存，于一个星期内检测，要求结合所提供的公共卫生突发事件场景相关信息进行食源性致病菌分离鉴定。

1.2 试剂所用干粉培养基、血平板、细菌生化鉴定管为杭州天和微生物试剂有限公司及北京陆桥技术有限责任公司生产；科玛嘉显色培养基购于郑州博赛生物技术股份有限公司；诊断血清为兰州生物制品研究所生产；API20E微生物鉴定试纸条及配套试剂购于法国梅里埃中国有限公司。

所有检测试剂均在有效期内。

1.3 检测标准依据《食品卫生微生物学检验》[2]、《食品安全国家标准食品微生物学检验》[3]、变形杆菌食物中毒诊断标准及处理原则(WS/T 9-1996)[4]、感染性腹泻的诊断标准及处理原则（GB17012-1997）[5]、扬通徐镇泰实验室间比对试验作业指导书（微生物部分）。

1.4 方法1.4.1 2009年比对样品将检样直接接种于血平板、SS、TCBS、EMB、山梨醇麦康凯上，36.5℃培养22h，除血平板上生长两种菌落外，其余选择性培养基均为一种菌落生长，将此菌株定为1号菌，血平板上生长较慢细小菌落定为2号菌，继续培养至48h，挑取单个菌落转种血平板分离培养20h，转种科玛嘉李斯特菌显色培养基，36.5℃培养48h，挑取1号菌接种TSI斜面培养基，TCBS上的单个菌落接种3.5%NacL TSI斜面培养基，36.5℃培养20h。

1.4.2 2010年比对样品将检样直接接种于血平板、SS、EMB、山梨醇麦康凯、科玛嘉李斯特菌显色培养基、科玛嘉弧菌显色培养基上，36.5℃培养24h，除科玛嘉显色培养基上无菌生长外，其余选择性培养基上均有两种菌落生长，分别编以1、2号菌。

挑取单个菌落接种于TSI斜面培养基上，36.5℃培养21h。

1.4.3 2011年比对样品将检样直接接种于血平板、SS、山梨醇麦康凯、TSA、EMB、普通营养琼脂、科玛嘉李斯特菌显色培养基、科玛嘉弧菌显色培养基、科玛嘉O157显色培养基、沙门菌属显色培养基上，36.5℃培养24h，四种显色培养基上均无菌落生长，其余培养基上均有两种菌落生长，分别编以1、2号菌。

挑取单个菌落接种于TSI斜面培养基上，36.5℃培养24h。

2 结果2.1 分离培养特点2.1.1 2009年比对样品血平板上的1号菌落中等大小、湿润灰白色，无溶血环；2号为灰白色细小菌落，可见透明溶血环。

SS平板上可见无色半透明、中心带黑色菌落。

李斯特菌显色培养基上可见细小、圆形蓝色菌落，周围有白色晕圈。

2.1.2 2010年比对样品血平板上1号菌落较大，光滑、圆形，有β溶血环；2号菌落较小，光滑、圆形、透明。

EMB平板上1号菌落扁平、粉红色、有金属光泽；2号菌落较小，无色透明。

SS平板上1号菌落中央红色；2号菌落较小，无色透明。

山梨醇麦康凯平板上1号菌落不发酵山梨醇，圆形、光滑、较小的无色菌落；2号菌落发酵山梨醇，粉红色、圆形、光滑、较小菌落。

2.1.3 2011年比对样品血平板上1号菌落中等大小蔓延生长，有轻微溶血；2号菌落中等大小，无溶血。

在EMB平板上1号菌落呈片状蔓延生长，2号菌落较大，紫红色。

TSA平板上1号菌落无色半透明、蔓延生长；2号为圆形、半透明黄色菌落。

2.2 细菌鉴定2.2.1 形态与染色2.2.1.1 2009年比对样品1号菌经涂片染色镜检，为革兰阴性杆菌，无芽孢；2号菌为革兰阳性短杆菌。

2.2.1.2 2010年比对样品1号菌经涂片染色镜检，为革兰阴性短杆菌；2号菌为革兰阴性球杆菌，两端浓染。

2.2.1.3 2011年比对样品1、2号菌经涂片染色镜检，均为革兰阴性杆菌。

2.2.2 生化试验2.2.2.1 2009年比对样品1号菌株TSI斜面培养基结果为K/AG, H2S阳性。

对分离到的两种菌株进行生化鉴定，生化反应结果如下：硫化氢+ 靛基质- PH7.2尿素- 氰化钾- 赖氨酸脱羧酶+ ，其生化鉴定结果符合沙门菌的生化反应特点；2号菌株的生化反应结果如下：葡萄糖+ 麦芽糖+ MR-VP +/+ 甘露醇- 鼠李糖+ 木糖- 七叶苷+ 溶血反应：在刺种点周围可见狭小透明溶血环，其生化鉴定结果符合单核细胞增生李斯特菌的生化反应特点。

2.2.2.2 2010年比对样品1号菌TSI斜面培养基结果为A/AG，H2S阴性。

对分离到的两种菌株进行生化鉴定，生化反应结果如下：氧化酶- 靛基质- KCN - 尿素- VP - 山梨醇- 西蒙氏柠檬酸盐- 赖氨酸脱羧酶+ 鸟氨酸脱羧酶+ 棉子糖+ 纤维二糖- MUG - 动力+ ，其生化鉴定结果符合大肠埃希菌O157的生化反应特点；2号菌TSI斜面培养基结果为A/A，H2S阴性，不产气；生化反应结果如下：尿素+ 鸟氨酸脱羧酶+ 蔗糖+ 棉子糖- 山梨醇+ 甘露醇+ 鼠李糖- VP（26℃）+ 动力（26℃）+ ，其生化鉴定结果符合小肠结肠炎耶尔森菌的生化反应特点。

2.2.2.3 2011年比对样品1号菌TSI斜面培养基结果均为K/AG，H2S阳性；2号菌TSI斜面培养基结果均为A/AG，H2S阴性。

对分离到的两种菌株使用API20E生化试纸条鉴定，结果见表1，将该菌的21项生化每三个归为一组，赋予第1、2、3位置阳性值为1、2、4，阴性为0，结果相加获得这一组的值，共7个数值组成该菌的生化谱编码。

,从而得出1号菌的生化编码为0736020，经API20E生化鉴定系统查询，获得很好的鉴定结果，首选为奇异变形杆菌，id值为99.9%，T值为0.67，不符合试验1项为SAC；2号菌的生化编码为3307373，经API20E生化鉴定系统查询，获得极好的鉴定结果，首选为阪崎肠杆菌，id值为99.9%，T 值为0.84，不符合试验1项为GEL。

表1 2011年1、2号质控菌株API20E鉴定结果2.2.3 血清学试验2.2.3.1 2009年比对样品1号菌株1号菌株用沙门菌诊断血清做玻片凝集，A～F多价血清：++++ ；O1：++++ ；O19：++++ ；O3,19:++++ ；Hg:++++、Hs:++++，Ht:++,通过位相诱导，将菌株接种于0.6%的半固体琼脂平皿的中央，俟菌落蔓延生长时，取边缘菌落做血清凝集，Ht:++++ ，生理盐水对照阴性，抗原表达式为：1,3,19：g，s，t：-，最终鉴定为E4群山夫登堡沙门菌。

2.2.3.2 2010年比对样品1号菌株1号菌株用大肠埃希菌O157诊断血清做玻片凝集，O157：++++ ；H7：++++ ，生理盐水对照阴性，最终鉴定为大肠埃希菌O157：H7。

2.3 结果报告通过生化反应和血清学鉴定，2009-2011年从模拟肛拭子样品中均检出了两种致病菌。

经五市联合质控工作网确认，结果符合。

2.3.1 2009年比对样品1号菌株为山夫登堡沙门菌；2号菌株为单核细胞增生李斯特菌，排除了副溶血性弧菌、志贺菌、致泻大肠埃希菌及变形杆菌。

2.3.2 2010年比对样品1号菌为大肠埃希菌O157：H7；2号菌为小肠结肠炎耶尔森菌，排除了沙门菌、志贺菌、副溶血性弧菌、变形杆菌及单核细胞增生李斯特菌。

2.3.3 2011年比对样品1号菌为奇异变形杆菌；2号菌为阪崎肠杆菌，排除了沙门菌、志贺菌、副溶血性弧菌、致泻大肠埃希菌O157及单核细胞增生李斯特菌。

3 讨论在微生物盲样考核中，培养基的选择和制备是细菌分离的关键，在接到考核样本后，首先要认真阅读作业指导书，分析场景的相关信息，判断可能的细菌方向，选择合适的培养基进行细菌分离，在这几次的比对样品中，根据场景分析，无剧烈呕吐及潜伏期相对较长的特点，未考虑金黄色葡萄球菌引起的食物中毒。

显色培养基的使用可以作为细菌鉴定的指引，大大加快分离速度。

2009年的单核细胞增生李斯特菌、2010年的小肠结肠炎耶尔森菌及2011年的阪崎肠杆菌均是初次鉴定的菌株，尤其是2009年比对样品中的单核细胞增生李斯特菌比较少见，生长要求较高，除血平板经24小时培养后仔细观察可见1～2个针尖状菌落生长外，其余选择性培养基上均没有生长，这就要求我们在做盲样菌株鉴定时要思路开阔、考虑周全、轻易不要放过任何一个细小的菌落，对一些未知菌株的检测，可以首先使用营养丰富的血平板进行分离，培养时间可以延长至2-3天持续观察，尽可能保证不漏检，获得纯菌株后再进行鉴定。

常规检验方法中的革兰染色必须观察清楚,对检测方向的选择非常重要[6]。

通过染色镜检可以观察菌体形态和染色性质,有助于初步判断盲样中存在何种细菌,如2010年比对样品中的小肠结肠炎耶尔森菌，涂片镜检为革兰阴性球杆菌，两端浓染，结合TSI斜面培养基的结果,可以初步确定生化鉴定方向。

微生物实验室的细菌鉴定必须要按规范的细菌鉴定程序进行操作，对熟悉或不熟悉的菌株均应按先定科、属，种、型的鉴定程序进行各种试验的检测，绝对不能凭自己经验只做几项生化试验或血清凝集试验就轻易地下判断，而得出错误的鉴定结果。

随着检验标准化管理工作的逐渐深入, 质控程序也应规范化[7]。

2009年对单核细胞增生李斯特菌的鉴定就稍显粗糙，生化不完全，可补充的试验有：动力试验、氧化酶、过氧化氢酶试验、cAMP试验。

李斯特菌动力试验阳性，呈伞状或月牙状生长；氧化酶、过氧化氢酶试验阳性。