几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记抗体标记主要有酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记等，还有一些其他的标记方法例如金标记，本文主要讲述了这些抗体标记的基本原理、操作步骤。

、酶标记1 、辣根过氧化物酶(HRP) 标记辣根过氧化物酶(HRP) 标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘酸钠法。

其原理是HRP 的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入抗体IgG后该醛基与IgG 氨基结合，形成Schiff 氏碱。

为了防止HRP中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。

氧化反应末了，用硼氢化钠稳定Schiff 氏碱。

这里介绍两种程序。

程序一：(1)将5mg HRP 溶于0.5ml 0.1mol/L NaHCO3 溶液中加0.5ml 10mmol/LNaIO4 溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2 小时。

(2)加0.75ml 0.1mol/L Na2CO3 混匀。

(3)加入0.75ml 小鼠已处理的腹水，或纯化单抗等(15mg/ml) ，混匀。

(4)称取SephadexG25 干粉0.3g ，加入一支下口垫玻璃棉的5ml 注射器外筒内;随后将上述交联物移入注射器外套;盖紧，室温作用(避光)3小时或4C过夜。

(5)用少许PBS 将交联物全部洗出，收集洗出液，加1/20V 体积新鲜配制的5mg/mlNaBH4 溶液，混匀，室温作用30 分钟;再加入3/20V NaBH4溶液，混匀，室温作用1小时(或4C过夜)。

(6)将交联物过Sephadex g200 或Sepharose6B(2.6 X 50cm)层析纯化，分管收集第一峰。

(7)酶结合物质量鉴定：克分子比值测定酶量(mg/ml)=OD403 X 0.4IgG 量(mg/ml)=(OD280- OD403X 0.3) X 0.62克分子比值(E/P)=酶量X 4/IgG量，一般在1-2之间。

酶结合率=酶量X体积/抗体，标记率一般为0.3-0.6，即1-2个HRP 分子结合在一个抗体分子上，标记率可大于0.6，0.8，0.9;OD403/OD280 等于0.4 时，E/P 约为1 。

标记率=OD403/OD280酶活性和抗体活性的测定可应用ELISA 法、免疫扩散、DAB-H2O2 显色反应测定酶结合物的酶活性，抗体活性及效价、特异性。

(8)HRP 抗体结合物的保存：加入等量甘油后，小量分装-20C存放，防止反复冻融；或加入等量60%甘油4C保存；不宜加NaN3 或酚防腐，否则会影响酶活性。

必要时冻干保存，以BSA 或脱脂牛奶作保护剂。

程序二：(1)将5mg HRP 溶于0.3mol/L PH8.1NaHCO3 溶液中，加入1%二硝基氟苯无水乙醇溶液0.1ml，室温搅拌作用1小时，以封闭HRP分子上的a和£氨基。

(2)再加1ml 0.06mol/L 过碘酸钠溶液，在室温中避光轻搅30 分钟，溶液呈黄绿色；随后加1ml 0.06mol/L乙二醇，轻搅1 小时，中止氧化反应。

(3) 移入透析袋中，在1000ml 0.01mol/LPH9.5 碳酸盐缓冲液中，4C透析过夜，更换三次缓冲液，注意避光。

(4) 吸取上述醛化好的HRP溶液3ml，加入5mg IgG的碳酸盐缓冲液1ml ，室温轻搅2-3 小时，避光；加入5mgNaBH4 , 4C放置3小时或过夜，或换用乙醇胺(2mol/LPH9.5)0.2ml ，作用7 小时。

(5)再移入透析袋中，在0.02mol/L PH7.4 PBS 中透析24 小时，更换三次缓冲液。

(6) 用 3000r/min 离心 30 分钟，除去沉淀物。

上清液再用半饱和硫酸铵盐析三次，沉淀用少许 PBS 溶解，透析或层析除盐，必要时进一步层析纯化。

碱性磷酸酶 (AP) 用于标记抗体，常用戊二醛一步法，将酶和单抗混合， 再加入适量戊二醛， 使酶和抗体蛋白的 NH2分别与两个醛基结合，制备成结合物。

该法简便，但所得产 物不均一，抗体活性损失大，酶标记率低。

其程序如下：(1) 将 5mg AP 加入 1ml 抗体溶液 (2mg/ml) 中溶解，装入透析袋，于 4C 对 0.01mol/L PH7.2PBS 透析 18 小时，换液三次。

⑵加入2.5%戊二醛20ul ，室温作用1-2小时，4C 对PBS 透析过夜，其间换液三次。

(3) 换用 0.05mol/L PH8.0 Tris-HCl 夜，换液三次。

(4)取出标记抗体， 用含 1%BSA 的 Tris-HCl 缓冲液稀释至 4ml ，即为 AP 标记物原液。

(5)每毫升中加入 0.4ml 甘油，小3、PAP 、APAAP 的制备PAP( 过氧化物酶 -抗过氧化物酶桥联酶标技术 )、APAAP( 碱性磷酸酶 -抗碱性磷酸酶桥联酶标技术 ) 的制备对 于日益广泛使用单抗的免疫细胞化学有重要意义。

现在已有 商品化的小鼠、大鼠、豚(7) 、(8)步骤同程序一。

2、碱性磷酸酶 (AP) 标记缓冲液透析，4C 过鼠、山羊、绵羊和兔PAP 、APAAP 试剂供应，只要配以相应的桥抗体，即可非常便利地应用单抗。

因为PAP 法和APAAP 法不用任何化学交联剂处理酶和抗体，它们的活性均不受化学因素的影响，提高了敏感性和特异性。

PAP 和APAAP 试剂的制备方法常采用先将HRP或AP 加入抗HRP 或AP 的抗血清或单抗中而获得免疫沉淀物，再加入酶盐水，过量的酶有助于免疫沉淀物的解离反应，调PH 至2.3 ，随后立即中和，除去不溶解的沉淀物后，加入半饱和硫酸铵，纯化PAP 或APAAP 。

根据需要还可将PAP 和APAAP 试剂先与相应桥抗体结合后，再与特定单抗组成完整的诊断试剂，这样，单抗即可步法用于诊断或检测试验等。

二、荧光素标记1 、异硫氰酸荧光素(FITC) 标记FITC 标记抗体的原理是在碱性条件下，FITC 的异硫氰基能与IgG 的自由氨基结合，形成IgG 与荧光素的结合物。

FITC 是最常用的荧光素，其次选用TRITC( 四甲基异硫氰酸罗丹明)。

FITC和TRITC是常用的双标记组合。

其标记步骤如下：(1)以碳酸盐缓冲液(PH9.3 ，Na2CO3 8.6g ，NaHCO317.3g ，蒸馏水1000ml) 调整抗体浓度至10mg/ml 。

(2)取5ml 抗体溶液置于10ml 小烧杯中。

(3)称取1mg FITC 溶于0.2mlDMSO 中，待溶解后立即缓慢滴加于抗体液内，边加边轻搅; 其后室温避光作用2 小时。

(4)将交联物经Sephadex G25 或G50 柱层析除去游离的荧光素;分管收集第一峰为标记的抗体。

(5)FITC 的结合物质量鉴定IgG 量(mg/ml)=(OD280- OD495X 0.35)/1.4F/P=2.87 X OD495/(OD280 -OD495X 0.35)，一般说，FITC 对抗体的摩尔比为3：1 时适合于组织切片染色，为5-6：1 时适合于细胞悬液染色。

以标记抗体染色各种抗原，测定其特异性染色滴度和非特异染色的程度。

(6)标记抗体的保存：宜保存于4C,加NaN3防腐。

2 、异硫氰酸罗丹明(TRITC) 标记：基本与FITC 标记相同。

、同位素标记必须强调的是在使用同位素标记单抗或其他蛋白之前，应掌握同位素操作和防护知识。

正常情况下应包括避免物理的接触和对Y-射线照射的有效保护，操作和使用同位素标记抗体时，应利用防护装置，并合理处置含放射性的废料1、碘标记用碘标记抗体是一种有效的标记方法。

125I 衰变产生低能的Y和X射线，很容易被检测出来，而其60天的半衰期保证足够的有效使用期，且能很方便地处理放射废料。

最常用的碘标记方法是氯胺T 法，即将氧化剂氯胺T 加入到抗体和碘化物的溶液中，Na125l 在氯胺T作用下I转化成12，游离I2 可与抗体分子中酪氨酸和一些组氨酸发生卤化反应，用还原剂和游离酪氨酸终止反应，经凝胶过滤将标记的抗体与碘化酪氨酸及还原剂分离开。

其主要操作步骤如下：(1) 在进行标记之前，先选用截流分子量为20000-50000的凝胶，制备1ml 凝胶柱，然后分别用10 倍体积的1%BSA/PBS/0.02% 叠氮钠和PBS 洗涤柱体，封住柱下口，备用。

(2)加入10ug 纯化单抗至含有25ul 2.5mol/L 磷酸钠(PH7.5) 的1.5ml 指形管内。

随后，加入500uCiNa125I 混匀。

⑶加入25ul新配制的2mg/ml氯胺T。

室温放置60秒。

再加入50ul 氯胺T 终止液(含2.4mg/ml 偏重亚硫酸钠，10mg/ml 酪氨酸，10%甘油和0.1% 环乙烷酰二甲苯的PBS)。

(4)将上述碘标记物上样在凝胶柱表面，小心放开柱体下口，用1.5ml 指形管收集。

当碘标记物全部进入柱体，加入0.3ml 含0.03% 叠氮钠的PBS ，用另一指形管收集0.3ml ，然后再加0.3ml 0.03% NaN3PBS ，下口收集0.3ml ，重复进行，同时用同位素检测仪测定标记与未标记的单抗。

标记抗体大约在第二至第四管出现。

无害化处理柱子和非单抗标记部分。

(5)将标记单抗保存于4 C可使用6周时间。

2、生物合成法标记将杂交瘤细胞培养在含有放射性前体的培养基中，随着抗体分子的合成、组装，同位素会标记在抗体分子的初级氨基酸链上，本方法不会导致抗体活性的丧失。

其主要步骤是：(1)离心收集处于对数生长期的杂交瘤细胞，约需2X 106个细胞。

以预热37C不含甲硫氨酸的培养基洗涤上述细胞。

(2)用含2%PBS不含甲硫氨酸的培养基悬浮杂交瘤细胞至106个/ml，加入35S 甲硫氨酸(每次加入100uCi 可产生105-106cpm 的抗体)。

(3)经C02 培养箱中培养过夜，离心后，吸出培养上清，分别加入1/20 体积的1mol/LTris(PH8.0) 及叠氮钠至浓度0.02% 。

该标记抗体可按纯化单抗方法进行。

四、生物素标记生物素标记反应常用生物素琥珀酰亚胺酯进行。

生物素是与抗体分子的游离赖氨酸等发生偶联反应而完成标记。

其主要步骤是：1、用二甲基亚砜配制10mg/ml 的N- 羟琥珀酰亚胺生物素(应根据需要选用不同大小和间臂长的生物素化琥珀酰酯1-3mg/ml 。

温作用4 小时。

反应，室温放置10 分钟。

5 、以PBS 充分透析除去游离生物素，标记抗体冻存。

五、其他标记技术适用于蛋白质的其他标记方法也可用于单抗，如金标记、化学发光标记、SPA 标记、铁蛋白标记等。

免疫标记是一种操作简单、灵敏度高的技术，主要原理是级联方法效应。

单抗已经广泛用于疾病诊断等，主要是利用单抗标记的诊断试剂盒进行的。

)。

2 、用硼酸钠缓冲液(0.1mol/L ，PH8.0) 稀释单抗溶液至3 、每毫克抗体加入25-250ug 的生物素酯，混匀后，室4 、按每250ug 生物素酯加入20ul 1mol/L NH4Cl 终止。