《生物制药技术》实验指导实验一金霉素链霉菌培养基的制备（验证型）实验目的：1、学会培养基的配制2、掌握灭菌方法。

实验原理：金霉素链霉菌（Streptomyces aureofaciens）亦称“金色链霉菌”，放线菌门(Actinobacteria)，放线菌纲(Actinobacteria)，放线菌目(Actinomycetales)，链霉菌科(Streptomycetaceae)，链霉菌属(Streptomyces)。

在固体培养基上产生金色色素，故名。

其菌落为草帽型, 菌落直径一般为3～5毫米, 表面较平坦, 中间有隆起。

菌落开始为白色，长孢子后变青色。

在显微镜下可以看到短杆状的菌丝。

抗菌素工业上用以生产金霉素。

放线菌是一类介于细菌与真菌之间的单细胞微生物。

放线菌在土壤中分布最多，大多数生活在含水量较低、有机质丰富和微碱性的土壤中。

多数情况下，泥土中散发出的“泥腥味”就是由放线菌中链霉菌产生的土腥素造成的。

放线菌大都好氧，属于化能异养，菌丝纤细，分枝，常从一个中心向周围辐射生长。

因其生长具辐射状，故名放线菌。

放线菌能像真菌那样形成分枝菌丝，并在菌丝末端产生外生的分生孢子，有些种类甚至形成孢子囊，因而曾被误认是真菌。

但其菌落较小而致密，不易挑取。

不少菌种在医药、农业和工业上广泛应用，可产生抗菌素，现已发现和分离出的由放线菌产生的抗生素多达4 000多种，其中，有50多种抗生素已经广泛地得到应用，如链霉素、红霉素、土霉素、四环素、金霉素、卡那霉素、氯霉素等用于临床治疗人的多种疾病；有些可生产蛋白酶、葡萄糖异构酶；有的用于农业生产，如灭瘟素、井冈霉素、庆丰霉素等。

四环素类抗生素是由链霉菌生产或经半合成制取的一类广谱抗生素。

抗菌谱极广，包括革兰氏阳性和阴性菌、立克次体、衣原体、支原体和螺旋体。

品种主要包括金霉素、四环素和土霉素。

器材：1ml移液枪；铝锅；电炉试剂：NaBr母液（100 g／L）KCl母液（100 g／L）M-促进剂母液（2.5 g／L）实验步骤：1．种子培养基种子培养基(g／L)：可溶性淀粉40，黄豆饼粉20，酵母粉5，蛋白胨5，CaCO34，(NH4)2SO4 3，MgSO4·7H2O 0.25，KH2PO4 0.25。

先称取黄豆饼粉20g，单独煮沸10分钟，加入少量凉水降温，4层纱布压榨取汁，与其它称好的各成分混合，定容至1L。

每50ml分装到250ml三角瓶中，每组2瓶。

2．定向发酵培养基发酵培养基(g／L)：可溶性淀粉100，黄豆饼粉40，蛋白胨15，CaCO3 5，酵母粉2.5，(NH4)2SO4 3，MgSO4·7H2O 0.25，α—淀粉酶0.1。

配制方法同种子培养基，配好后分装到500ml三角瓶中，每瓶100ml，分别加入如下成分，比较它们对四环素产量的影响：(1)对照(不加其他成分)；(2)加入NaBr母液至终浓度为2g／L；(3)加入KCl母液至终浓度为2g／L；(4) 加入NaBr母液至终浓度为2g／L及M-促进剂母液至终浓度为0.025g／L。

每两组配一套。

3．灭菌将封好口的培养基121℃灭菌30min。

同时灭1ml 剪口移液枪头、1.5mL离心管。

（总过程：称量——溶化——定容——分装——封口——灭菌）注意事项：1．黄豆饼粉煮沸取汁。

2．培养基封口最好用8层纱布或棉花塞，最好不用橡胶塞，以增加透气性。

3．灭菌时锅内要补足水分。

由于灭菌锅较大，升温排气一定要充分（10min）。

补充阅读：工业发酵中利用生产菌发酵得出最终产物是一个逐级放大的过程，各个不同的阶段对于营养成分的要求也各有特点，根据发酵不同阶段的要求，培养基可分为孢子培养基、种子培养基和发酵培养基三种。

孢子培养基孢子培养基是供菌种繁殖孢子的一种常用固体培养基，对这种培养基的要求是能使菌体迅速生长，产生较多优质的孢子，并要求这种培养基不易引起菌种发生变异。

所以对孢子培养基的基本配制要求是：第一，营养不要太丰富（特别是有机氮源），否则不易产孢子。

如灰色链霉在葡萄糖－硝酸盐－其它盐类的培养基上都能很好地生长和产孢子，但若加入0.5%酵母膏或酪蛋白后，就只长菌丝而不长孢子。

第二，所用无机盐的浓度要适量，不然也会影响孢子量和孢子颜色。

第三，要注意孢子培养基的pH和湿度。

生产上常用的孢子培养基有：麸皮培养基、小米培养基、大米培养基、玉米碎屑培养基和用葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏和食盐等配制成的琼脂斜面培养基。

大米和小米常用作霉菌孢子培养基，因为它们含氮量少，疏松、表面积大，所以是较好孢子培养基。

种子培养基种子培养基是供孢子发芽、生长和大量繁殖菌丝体，并使菌体长得粗壮，成为活力强的“种子”。

所以种子培养基的营养成分要求比较丰富和完全，氮源和维生素的含量也要高些，但总浓度以略稀薄为好，这样可达到较高的溶解氧，供大量菌体生长繁殖。

种子培养基的成分要考虑在微生物代谢过程中能维持稳定的pH，其组成还要根据不同菌种的生理特征而定。

一般种子培养基都用营养丰富而完全的天然有机氮源，因为有些氨基酸能刺激孢子发芽。

但无机氮源容易利用，有利于菌体迅速生长，所以在种子培养基中常包括有机及无机氮源。

最后一级的种子培养基的成分最好能较接近发酵培养基，这样可使种子进入发酵培养基后能迅速适应，快速生长。

发酵培养基发酵培养基是供菌种生长、繁殖和合成产物之用。

它既要使种子接种后能迅速生长，达到一定的菌丝浓度，又要使长好的菌体能迅速合成需产物。

因此，发酵培养基的组成除有菌体生长所必需的元素和化合物外，还要有产物所需的特定元素、前体和促进剂等。

但若因生长和生物合成产物需要的总的碳源、氮源、磷源等的浓度太高，或生长和合成两阶段各需的最佳条件要求不同时，则可考虑培养基用分批补料来加以满足。

实验二金霉素链霉菌的定向发酵（验证型）实验目的：1、学习和掌握无菌操作技术。

2、掌握定向发酵四环素的原理。

实验原理：定向发酵是指通过改变培养基组分(加入某些物质)改变微生物代谢途径，使发酵按主观要求产生较多的产物。

金霉素、四环素和土霉素，它们的化学结构极为相似：R1 R2金霉素Cl H土霉素H OH四环素H H金霉菌原是产生金霉素（Chlortetracycline）的菌种，但因金霉素比四环素只多一个氯离子，所以只要在发酵液中加入某些物质，阻止氯离子进入四环素分子，从而使菌种产生较多的四环素。

另外，金色链霉菌在30℃以下时，合成金霉素的能力较强；当温度超过35℃时则只合成四环素。

本实验中，利用溴离子在生物合成过程中对氯离子有竞争性抑制剂作用的原理，以及加入2-硫醇基苯并噻唑(即M—促进剂，分子式：C7H5NS2，通常作为橡胶硫化促进剂)抑制氯化酶的作用，从而增加四环素的产量。

材料和试剂：金霉素链霉菌：购于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（菌种保藏号：CGMCC4.1043；订单号20111133 550元）。

实验步骤：前期准备工作：配制斜面培养基（可选，1号培养基由菌种保藏中心提供）1、麸皮36.0 g，K2HPO4 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，（NH4）2HPO4 3 g，琼脂15～20 g，定容至1L，pH 7。

2、可溶性淀粉20g，KN O3 1g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，定容至1L，pH 7.2~7.5。

1、制备斜面孢子：将保藏的菌种的比例接种于液体培养基中（不加琼脂的斜面培养基），28℃下200 r/min振荡培养，将活化1d后的金霉素链霉菌种接入斜面培养基，28℃培养5～7天，待孢子长成灰色，于4℃冰箱中保藏。

2、种子培养：在斜面上用接种铲挑取1cm2左右生长良好的菌体接入装有50ml四环素种子培养基的250ml锥形瓶中，230 r/min、28℃下振荡培养20～24h。

3、发酵培养：以剪口移液枪头取10 ml种子液接入装有100ml发酵培养液的500ml锥形瓶中（注意：同一处理组用同一瓶种子液接种），230 r/min、28℃下振荡培养5 d。

用于后面的测定效价和薄层层析实验。

四环素的提取和精制（选作）一、实验目的1 ．掌握沉淀法精制四环素的原理、方法和基本操作技术。

2 ．熟悉pH 的控制与产量、质最的关系。

二、实验原理四环素为两性化合物，其等电点为5.4 。

当溶液pH 等于等电点时，四环素呈游离碱形式，从水溶液中沉淀出来。

利用四环素的这一性质，可将四环素从发酵液中提取出来。

在连续结晶过程中，pH 的高低对产量、质量都有一定的影响。

四环素的等电点为5.4 , 在pH 4.5~7.5 之间，游离碱在水中的溶解度乎不变。

若pH 控制在接近等电点时，沉淀结品虽然比较完全，收率也高，但此时会有大量杂质同时析出，影响产品的色泽和质量；若pH控制得较低一些，对提高产品质量虽有好处，但沉淀结晶不够完全，收率会低些，影响产量。

因此，在选择沉淀结晶pH 时，就必须同时考虑到产量、质量的效果。

在正常情况下，工艺上控制pH4.8左右。

若沉淀结晶质量较差，pH可控制得稍低些，有利于结晶质量的改善，但不能低于4.5，否则收率低，影响产量。

四环素的提取和精制分酸化、纯化、过滤、结晶和淋洗五个步骤。

(1 ) 酸化加入草酸，使积聚在菌丝体内的四环素尽可能多地成为可溶性盐，而转入液相。

四环素在酸性条件下较隐定，且草酸与钙离子反应生成不溶性的草酸钙，析出的草酸钙能促进蛋白质的凝固，提高滤液的纯度和过滤速度。

( 2 ）纯化纯化剂（黄血盐、硫酸锌和硼砂）与草酸一起混合作用，可以除去发酵液中大量酸溶性蛋白质、铁离子和其他多种离子色素以及其他杂质，从而使滤液纯净，并减少发酵液的粘度，利于过滤。

其中纯化剂黄血盐能与发酵液中的铁离子作用，生成普鲁士盐而除去铁离子。

( 3 ）过滤通过过滤，使四环素溶液与菌丝体以及其他杂质分离，再经过复滤、精滤，进一步提高滤液质址，得到澄清的滤液。

( 4 ) 结晶将滤液的pH调节到等电点，在较低温度下析出纯净的四环素。

( 5 ）淋洗虽然发酵液经酸化后大部分四环素已溶入溶液中，但仍有部分残存在菌渣中，且过滤不可能十分彻底。

所以用酸水淋洗，以提高收率。

三、实验试剂及仪器1．试剂300 g/L草酸溶液、200 g/L 黄血酸钾溶液、200 g/L 硫酸锌溶液、200 g/L 硼砂溶液、浓氮水、3 g/L草酸溶液。

2．仪器1000 mL 烧杯、搅拌器、布氏漏斗、抽滤瓶、滤纸、量筒、pH 试纸、酸度计、温度计、水泵、表面皿。

四、实验步骤1．酸化取600ml 四环素发酵液，置装有机械搅拌的1000 mL烧杯中，开始搅拌，待发酵液温度降至20 ℃以下时，缓缓加入草酸溶液，草酸加入量为27～35g/L，并不时测定发酵液的pH。