RT－PCR原理与技术简介
1
2
Your site here
常规引物设计
• 引物设计原则
• Primer5和Oligo6进行引物分析
Your site here
引物设计原则
1. 引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因为过 长会导致其延伸温度大于74℃，即Taq 酶的最适温度。 2. 引物3’端的序列要比5’端重要。引物3’端的碱基一般不用A，因为A在错误引
异亮氨 酸 丝氨酸
Isoleucine Serine
Ile Ser
I S
AUU AUC AUA AUG UCU UCC UCA UCG AGU AGC
色氨酸 苯丙氨酸 酪氨酸 蛋氨酸 胱氨酸
Tryptophan Phenylalanine Tyrosine Methionine Cysteine
Trp Phe Tyr Met Cys

循环数增加至50 cycles

电泳检测至关重要
不用二次扩增重复结果

Your site here
后续研究
应用半定量或定量PCR法研究营养物质等对该基因 表达水平的影响 使用RACE法进行基因cDNA全长扩增
进行蛋白质结构预测
1992年10月，NCBI承担起对GenBank DNA序列数据库的责任。 NCBI工作人员通过来自各个实验室递交的序列和同国际核酸序列数 据库（EMBL和DDBJ）交换数据建立起数据库.
Genebank是遗传序列数据库，一个所有可以公开获得的DNA序列 的注释过的收集。 GenBank以指数形式增长，核酸碱基数目大概每 14个月就翻一个倍。最近，GenBank拥有来自47,000个物种的30亿 个碱基。
Your site here
应用BLAST进行同源序列搜索
a. 剪切然后粘贴DNA或蛋白序列； b. 使用FASTA格式的序列； FASTA格式的序列以一个单行的说明开始，说明行 以其开始处的一个大于号（>）与序列数据区分开。 说明行以下是序列数据。 c. 简单使用访问编号：RefSeq或Genebank序号。
/
Your site here
中 文 甘氨酸 丙氨酸 缬氨酸 亮氨酸
英 文 Glycine Alanine Valine Leucine
缩写 Gly Ala Val Leu G A V L
密码子 GGU GGC GGA GGG GCU GCC GCA GCG GUU GUC GUA GUG CUU CUC CUA CUG UUA UUG
Your site here
Sub title
查找核酸/氨基酸序列
NCBI常用功能
序列相似性分析
引物验证
一、查找核酸、氨基酸序列
1.以鸡FAT/CD36为例，search：
2.调整右侧检索目录，tree--list：
Your site here
3.浏览信息，下载序列，并以Genebank、FASTA格式保存
Blast 引物验证
最为重要的环节：对自己设计的引物或文献报道的引物进行测试
1.登陆NCBI——Blast——Primer-BLAST: /
Your site here
以文献报道鸡的MUC2的引物为例：
Your site here
Your site here
组氨酸
Histidine
His
H
CAU CAC
DNAMAN分析序列保守区
对Gallus、Taeniopygia、Mus、Ruttus的I-FABP的CDS进行分析得 到保守区序列
Your site here
CODEHOP
原理
方法：
http://bioinformatics.weizmann.ac.il/blocks/codehop.html
2.进入NCBI 3.点击Basic BLAST中的nucleotide blast选项
Your site here
Your site here
4.寻找相近物种，比较相似性
Your site here
点击score，获得相似性比较具体信息
NCBI官方说明：/BLAST/tutorial/Altschul-1.html
W F Y M C
UGG UUU UUC UAU UAC AUG UGU UGC
Your site here
苏氨酸 赖氨酸 精氨酸
Threonine Lysine Arginine
Thr Lys Arg
T K R
ACU ACC ACA ACG AAA AAG CGU CGC CGA CGG AGA AGG
Blast 序列相似性分析
1.修改测序结果，剔除克隆载体序列
在测序结果中找到上下游引物对应位置，剔除引物外的多余部分
以鸽子的I-FABP片段为例：
上游引物：5‘-AGRAARYTDGSAGCYCAC-3’ 下游引物： 5‘- TCHGTYCCRTCWGCBAGA-3‘
GCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATTAGGAAGTTAGGAGCCCACGATAATCTGAAGATCACTATTCAACAAGATGGAAACAAATTTACGGTCA AAGAATCAAGCAACTTCCGTACTATAGATATTGAATTCACTCTGGGAGTCAATTTTGACTACAGTCTCGCTGACGGAACGGAAATCTCTAGAGGATCC CCGGGTACCGAGCTCGAATTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCA TAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAG CTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCG GCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGT… …
Your site here
简并引物设计
简并引物：在常规引物的某些位点上 以简并核苷酸代替。
More of an art than a 降低简并度（500以下） 例如：上游 D Y N P V L F D L N G
Symbol Definition B not A D not C H not G I Inosine K G or T/U M A or C science N A,C,G or T/U R A or G S C or G V not T/U A or T L W Y C or T/U
Your site here
引物设计与简并PCR
RT－PCR原理与技术简介 引物设计过程
简并PCR技术
后续研究
Your site here
RT－PCR原理与技术简介
DNA
mRNA
Northern blot 半定量RTPCR 定量RTPCR
蛋白质
酶活力
Western blot
Your site here
主要的Blast程序：
程序名 Blastn Blastp Blastx Tblastn TBlastx 查询序列 核酸 蛋白质 核酸 蛋白质 核酸 数据库 核酸 蛋白质 蛋白质 核酸 核酸 搜索方法 核酸序列搜索逐一核酸数据库中的序列 蛋白质序列搜索逐一蛋白质数据库中的序列 核酸序列6框翻译成蛋白质序列后和蛋白质数据 库中的序列逐一搜索。 蛋白质序列和核酸数据库中的核酸序列6框翻译 后的蛋白质序列逐一比对。 核酸序列6框翻译成蛋白质序列，再和核酸数据 库中的核酸序列6框翻译成的蛋白质序列逐 一进行比对。
序列同源性分析：
是将待研究序列加入到一组与之同源，但来自不同物种的序列中进 行多序列同时比较，以确定该序列与其它序列间的同源性大小。这 是理论分析方法中最关键的一步。完成这一工作必须使用多序列比 较算法。常用的程序包有DNAMAN、CLUSTAL等
Your site here
Blast简介
BLAST ： “局部相似性基本查询工具”(Basic Local Alignment Search Tool) 的 缩写，是由NCBI开发的一个基于序列相似性的数据库搜索程序。
下游
N G
K
Q
1. 根据密码子表建立引物系列
http://www.kazusa.or.jp/codon/
2. 谨慎使用次黄嘌呤
Your site here
简并引物设计过 程
传统方法（适用于保守度高序列） • 应用BLAST进行同源序列搜索
• 应用DNAMAN选择保守区域（氨基酸或核苷酸） • 简并引物设计原则 • Primer5和Oligo6进行引物分析 CODEHOP法（适用于保守度低序列）
发位点的引发效率相对比较高。另外引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也
可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR 影响不大。 3. 引物的GC含量一般为40-60%，以45-55％为宜，过高或过低都不利于引
发反应。PCR引物的GC/AT比率应当等于或高于所要放大的模板的GC/AT
比。 4. ΔG值(自由能)反映引物与模板结合的强弱程度。一般情况下，引物的ΔG值 最好呈正弦曲线形状，即5’端和中间ΔG值较高，而3’端ΔG值相对较低，且 不要超过9（ΔG值为负值，这里取绝对值）。 引物二聚体及发夹结构的能量 一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体带。