二、细菌得简单染色与革兰氏染色1、革兰氏染色中那一步就是关键?为什么？您就是如何操作得？革兰氏染色得关键步骤就是：乙醇脱色(就是脱色时间)。

如果脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认为就是革兰氏阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也可被脱色而被误认为就是革兰氏阳性菌。

脱色时间得长短还受涂片得厚薄，脱色就是玻片晃动得快慢及乙醇用量得多少等因素得影响，难以严格规定（脱色就是应当控制速度，脱色时间一般为20—3０ｓ）。

2、固定得目得之一就是杀死菌体，这与自然死亡得菌体有何不同?自然死亡得菌体本身已经部分自溶，结构已经改变。

固定杀死细菌时细菌结构就是保持死亡时得状态得.3、不经复染这一步能否区分革兰氏阳性菌与阴性菌？能。

在酒精脱色后,不被酒精脱色而保留紫色者为革兰氏阳性菌(Ｇ＋)，被酒精脱色为革兰氏阴性菌。

最后一步用番红染液复染,就是为了让结果更清楚。

4、涂片为什么要固定,固定适应注意什么问题？ａ杀死细菌并使菌体黏附与玻片上;b 增加其对染料得亲与力。

固定时应注意：手持玻片，菌膜朝上，在微火过3次(手指触摸玻片反面，不烫手为宜）,固定时应尽可能维持细胞原有形态,防止细胞膨胀或收缩.三、霉菌、放线菌得形态观察1、镜检时,如何区分基内菌丝与气生菌丝？一般气生菌丝颜色较深，直生或分枝丝状，比基内菌丝粗;而基内菌丝色浅、发亮，可瞧到横隔膜,继而断裂成球状或杆状小体。

2、显微镜下细菌放线菌酵母菌与霉菌得主要区别就是什么？放线菌与细菌需要在油镜下才能观察清楚，而霉菌与酵母菌在低倍镜下即可瞧到。

细菌：为细而短得单细胞微生物（个体微小）,主要形态有:球、杆、螺旋状等。

(部分杆菌还可形成芽孢）放线菌:存在分枝丝状体与菌丝体,革兰氏阳性菌，有孢子丝与孢子(球形、椭圆形、杆状、柱状）。

酵母菌:单细胞，菌体呈圆球、卵形或椭圆形，少数呈柠檬形、尖形等。

菌体比细菌大几倍到几十倍,部分处于出芽繁殖过程中菌体还可观察到芽体，大多数菌体上还有芽痕。

霉菌:菌丝与孢子得宽度通常比细菌与放线菌粗得多，常就是细菌菌体宽度得几倍到几十倍,在低倍镜下即可瞧到，并还可瞧到孢子囊梗、囊轴、孢子囊、包囊孢子等.四、玻璃器皿得洗涤、包扎与灭菌1、高压蒸汽灭菌开始时为什么要将锅内排尽？灭菌后为什么要待压力降低到“0"时，才能打开排气阀，开盖取物?因为空气得膨胀压大于水蒸汽得膨胀压,所以，当水蒸汽中含有空气时,在同一压力下，含空气蒸汽得温度低于饱与蒸汽得温度。

如果压力未降到0时,打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内得培养基由于内外压力不平衡（压力突然下降而发生复沸腾）而冲出烧瓶口或试管口，造成培养基等液体沾湿棉塞或溢出等事故.2、设计实验方案，比较干热灭菌与湿热灭菌得效果。

以下试验方案有关操作均遵循无菌操作条件与等量原则。

（一）实验材料试管镊子酒精灯嗜热脂肪芽孢杆菌A TＣC7053菌片纸片（与菌片同大小同材料) 溴甲酚紫蛋白冻水培养基（已灭菌)等实验材料（材料有余）。

（二）对照组取9支洁净试管,分为A1Ｂ1 C1 三组(每3支一组),将A1 组中放入菌片，B1 组中放入纸片,C1组中什么也不加;不经灭菌，直接加入溴甲酚紫蛋白冻水培养基（等量）。

（三）恒为培养将上述所有试管按分组在５6℃恒温条件下培养４8小时.3、为什么干热灭菌比湿热灭菌所需温度高时间长?在湿热条件下,有水蒸汽得作用：a高温水蒸汽导热比干空气要快；b高温水蒸汽冷凝变水时有放热过程；c高温水蒸汽能穿透细菌得细胞膜，直接进入细胞内破坏细胞；c高温水蒸汽能水解一部分细胞结构,加速导热。

(湿热中细菌菌体吸收水分,蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低;湿热得穿透力比干热大；湿热得蒸汽有潜热存在,每１克水在1０0℃时，由气态变为液态时可放出２.26kJ（千焦)得热量。

这种潜热，能迅速提高被灭菌物体得温度，从而增加灭菌效力。

）五、培养基得配置1、配制牛肉膏蛋白胨培养基,有哪些操作步骤?那几步易出错，如何防止？称取药品—加热溶化—分装—加棉塞—包扎—灭菌—搁置斜面易出错得步骤有：a 称取药品称取时钥匙专用，瓶盖不要错盖，易吸水得药品要快速称取；b 加热溶化加入药品后要用玻璃棒不停搅拌，以免糊底(在琼脂熔化过程中，应控制火力，以免培养基因沸腾而溢出容器,同时，需不断搅拌，以防琼脂糊底烧焦.）；c分装分装时培养基不能粘在三角瓶（或试管)口，以免接种时染菌;d 搁置斜面斜面长度约试管长度一半为宜。

2、配制培养基得一般原则就是什么？a 目得明确ｂ营养协调c 理化适宜d 经济节约六、平板菌落计数法1、平板菌落计数法得原理就是什么？它适用于那些微生物得计数？平板菌落计数法就是将等测样品经适当稀释后，其中得微生物充分分散为单个细胞,取一定量得稀释液接种到平板上,经过培养,由每个单细胞生长繁殖而形成得肉眼可见得菌落,即一个单菌落应代表原样品中得一个单细胞。

统计菌落数,根据其稀释倍数与取样接种量即可换算出样品中得含菌数。

(但就是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成得一个单菌落也可能来自样品中得2~３或更多个细胞。

因此平板菌落计数得结果往往偏低。

现在常使用菌落形成单位）。

平板计数法就是根据微生物在固体培养基上所形成得一个菌落就是由一个微生物繁殖而形成得现象进行得，也就就是一个菌落可代表一种微生物(并不绝对)。

通常用来测定样品中所含细菌、孢子、酵母菌等单细胞微生物得数量.2、菌落样液移入培养皿后,若不尽快地倒入培养基并充分摇匀，将会出现什么结果？为什么？出现得结果就是:形成菌落过于集中,不能形成均匀分布得单菌落,导致无法计数。

因为:若不立即摇匀,菌体常会吸附在皿底上，不易形成均匀分布得单菌落，从而影响计数得准确性。

3、要获得本次试验得成功,那几步最为关键？为什么？a稀释菌液若在稀释时移液管混用可使稀释梯度不准确，从而导致计数误差(放菌液时吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只能接触一个稀释度得菌悬液，否则稀释不精确，结果误差大。

)；b 稀释倒平板 1 若再加入菌液不立即倒入培养基，可使菌体黏附于皿底;2 若不注意培养基温度,温度过高会将菌体烧死,温度过低会使培养基一倒入立即凝固，从而菌体不能均匀分布;3 倒入培养基需立即摇匀，否则菌体常会吸附在皿底上,不易形成均匀分布得单菌落,从而影响计数得准确性;４选择倒平板得稀释梯度也就是很重要得，一般以三个连续稀释度中得第二个稀释度倒平板后所出现得平均菌落数在50个左右为宜，否则要适当增加（或减少）稀释度加以调整。

4、平板菌落计数法与显微镜直接计数法相比有何优缺点？微生物显微镜直接计数法随机性大,所以对菌体数量不能做出较为宏观，全面得反应、显微镜直接计数法一般与血球计数板配套使用、但显微镜直接计数法得优点就是快速，观察到马上可以计数，而计得就是相应微生物总数。

平板菌落计数法最大得缺点就是速度慢，需要平板上长出菌落一段时间后才能计数、但就是由于平板菌落计数法通常做梯度稀释,所以计数得线性范围大、由于就是菌悬液涂布，所以比较均匀，能较好得反应菌落得疏密程度、重复性,平行性很好，而计得就是活菌数。

就是经典得计数方法、七、显微镜直接计数法1、为何用血细胞计数板可计得样品总菌值？叙述其适用范围。

a 计数室体积一定；b 在显微镜下，不经染色不能分辨菌体得死活，使计数所得得数目为一定体积内得总菌数,从而计得样品中总菌值.适用范围：可单细胞存在得细菌酵母菌或显丝状生长得真菌,放线菌所生得孢子等.２、为什么计数室内不能有气泡?试分析产生气泡得可能原因。

a气泡会占据计数室得空间,导致计数室中得菌体个数计数偏小，最后导致计数结果偏小.b 计数室内得气泡,可影响菌液得随机分布,使计数产生误差.产生气泡原因:a 操作不当,先放菌液再盖盖玻片；b 计数室洗涤不干净；c 盖玻片移动，造成空气进入而产生气泡。

３、试分析影响本实验结果得误差来源及提出改进措施？1、仪器误差:所用器材均应清洁干净，并且计数板计数区不应该有擦痕.2、计数室内可能有气泡。

因为酵母细胞并没有染色，瞧起来就是透明得,有气泡很容易被计入，使数值偏高;并且,气泡会影响菌悬液得随机分布。

改进:若产生气泡，则用吸水纸吸出。

3、菌体在计数板上分布不均，当用选取5格计数时，会造成很大误差。

改进:应使菌液自然流入并混匀,进行观察时尽可能多数几个格子。

4、配制稀释液时吸取得浓度过高或过低,导致稀释液浓度与原液不成正确比例，计算时产生误差.应将原液摇晃均匀后取中部得液体进行稀释。

5、由于数菌体数目时视觉疲劳而导致得视觉误差。

应多人观察，取记录平均数。

6、计数时可能将格四周得菌都计算在内了，使数值偏高。

改进：谨遵一个规则，计上不计下,计左不计右,不可以重复计数。

7、可能出现有出芽得酵母菌,将出芽得酵母菌按两个计数了,使数值偏高。

改进:计数时,只有当芽体于母细胞一样大得时候,才能计为两个。

8、微量移液器得最小量程太大,在加样时，容易加多,使盖玻片鼓起，血球计数板所技术得体积变大，最终结果偏大。

改进：用量程得小得微量移液器并少加一些。

八、微生物得纯培养技术１、如果一项科学研究内容需从自然界中筛选到能产生高温蛋白酶得菌株，您将如何完成？写出实验方案(产蛋白酶菌株在酪素平板上能形成降解酪素透明圈）。

以下试验方案有关操作均遵循无菌操作条件一材料准备1土壤【有机质（特别就是蛋白质)含量丰富得土壤】2 灭菌生理盐水（０、85％NaＣl)3灭菌移液管4 添加酪素得B—4（牛肉膏蛋白胨完全培养基)经灭菌5 B—4斜面(经灭菌）6其她材料：接种环酒精灯等二操作方法1在盛有1０ml灭菌生理盐水得烧杯中添加1g土壤，配成悬浮液；2 稍静止后，用灭菌移液管移取部分上清液，将其制成1０^4—10^6倍得稀释液;3 用灭菌移液管吸取各稀释液用稀释倒平板法（或涂布平板法)将其接入添加酪素得B—4平板上;4 在55—65℃下培养1—2天;５挑取形成降解酪素透明圈得菌落（透明圈直径Ｄ与菌落直径d之比较大者），转接入B-4斜面上培养；（若无特定菌落形成，则需另取土样从开始重复试验)6 将B—4斜面上得菌落再用平板纯培养，依次重复2—3次后即可得到纯培养（镜检）;7 纯培养细菌中蛋白酶得提取及活性鉴定【摇瓶培养(若提取蛋白酶及其活性正常,则纯培养成功,否则,重取土样重复以上实验）】.。