胎盘组织及血液中含有丰富的造血干/祖细胞周胜利,宋剑秋,旭 日(山东脐带血干细胞中心,济南250002)摘要 大量的临床移植表明人脐血(UCB)可以在造血干细胞移植的儿童中得到造血重建,可是在成人中脐血移植(UCB T)效果并不理想,这主要是脐血中所含的细胞数及造血干/祖细胞数有限,而不适宜体重较大的成人。
本研究在收集脐血的同时,也分别收集胎盘血(U PB)及胎盘组织(U PT)中的细胞,检测有核细胞数,CD34(造血干/祖细胞的表明标记)阳性细胞,粒单细胞集落(CFU2GM)。
结果发现:来自于胎盘血和胎盘组织中的有核细胞数是脐血细胞的3-4倍;脐血、胎盘血及胎盘组织细胞的有核细胞数分别为(8.3±1.04)×108,(16.33±5.54)×108和(8.01±2.64)×108;CD34+细胞分别为(0.77±0.01)×106,(1.25±0.55)×106和(4.21±1.90)×106;在细胞的长期培养中,U PB细胞和U PT细胞能生存更长时间,而且这些细胞更易贴壁形成纤维样的细胞;冰冻前后U PT细胞活性及回收率无明显差异,表明胎盘细胞和脐血细胞一样适合于长期储存;而且,在U PB和U PT中含有更高比例的T淋巴细胞抑制细胞群,可能意味着U PB和U PT具有更强的免疫抑制功能。
结论指出,有必要建立含有胎盘和脐血细胞的血库,以便为大剂量放疗及化疗后的儿童及成年病人进行造血干细胞移植,为重建造血创造条件。
关键词 脐血;脐血库;胎盘组织;胎盘血;造血干/祖细胞中图分类号 R714156;Q462Rich H ematopoietic Stem/Progenitor Cells in the H uman Placenta Tissue and Placenta BloodZHOU Sheng2Li,SON G Jian2Qiu,XU Ri(S handong U mbilical S tem Cell Center,Ji nan250002)Abstract Clinical transplantation evidence has indication that umbilical cord blood(UCB)can be useful in the hematopoietic reconstitution in the children,but not well in the adult patients because of the low cell count.The purpose of our study was to evaluate a new method for collection of blood cells from human placenta and umbilical cord.We have simultaneously harvested blood cells from umbilical cord(UCB),placenta blood(U PB)and placenta tissue(U PT)for their content of nucleated cells,CD34(hematopoietic stem progenitor maker)positive cells.Result showed that the nuclear cell(NC)from U PB and U PT has three to four times than that from umbilical cord blood only,(8.3±1.04)×108(UCB),(16.33±5.54)×108(U PB),and(8.01±2.64)×108(U PT).CD34+cells are(0.77±0.01)×106, (1.25±0.55)×106and(4.21±1.90)×106respectively.The cells from U PB and U PT have more survival ability than the cells from UCB in the long2term cell culture condition.It is clear that the blood stored in the liquid nitrogen did not show large loss of total nucleated cell count and CD34+cells.It was observed that U PT and U PB contained more suppressor lymphocytes,which may be important in prevention of graft2versus2host disease.In conclusion,our data may have implications for the development of placental blood collection together with umbilical cord blood banking for the stem cell transplantation.K ey w ords umbilical cord blood;umbilical cord blood bank;umbilical placenta tissue;umbilical placenta blood; hematopoietic stem/progenitor cell 在人类的胚胎发育中,造血干/祖细胞首先发生在胎儿卵黄囊中,4个月后转移到胎儿肝脏中生长分化,新生儿出生后就定位在骨髓中,由骨髓不断地生长出各种不同发育阶段的白细胞,红细胞和血小板。
人们曾经采用过富含造血干/祖细胞的胎肝用于造血干细胞移植,但由于来源困难以及细胞量的不足,而不能大规模用于临床。
近十余年来,人们已发现在脐血中含有丰富的造血干/祖细胞[1]。
脐血来源广泛,HLA配型对移植要求不严格,从而在世界各地纷纷建立起脐血库,开展脐血移植[2-4]。
到目前,全世界已开展近2000例脐血移植。
临床资料证明,脐血移植对于体重大于40公斤的病人的效果并不理想,即使在成功的儿童脐血移植中,血小板回 通讯作者:周胜利 电话:(0531)2999222-2502.传真:(0531) 2999533.E2mail:shengliz@・241・中国实验血液学杂志 Journal of Ex perimental Hem atology2002;10(2):142-147升时间也较骨髓移植为长[5]。
我们采用一种简单有效的方法分离胎盘中的细胞,发现在胎盘中有二类细胞,一类是切割胎盘后的胎盘血细胞(U PB),另一类是胎盘碾磨后的组织细胞(U PT),这二类细胞均含丰富的CD34阳性的造血干/祖细胞。
二类细胞的总数约为脐血细胞的3 -4倍。
这样,建立一座含有胎盘和脐血细胞的血库,就能有足够的细胞应用于儿童和成人间的造血干/祖细胞移植。
材料与方法孕产妇病史调查同脐血采集前的孕产妇调查[7]。
胎盘和脐血采集、组织配型、造血祖细胞集落培养及流式细胞术CD34+细胞计数方法同文献[7]。
深低温保存按K ogler等[10]脐血的深低温保存方法进行。
贮存细胞的冻融方法与脐血细胞的冻融相同[7]。
胎盘血和胎盘组织细胞的收集在收集完脐血后,尽可能保持胎盘的无菌状态和完整性,以无菌布包好后送到脐血库的无菌车间。
用无菌生理盐水冲洗净胎盘外的血迹,然后用双止血钳夹住脐带根部,用无菌剪刀在止血钳之间剪断脐带,以及去除附着于胎盘表面的包膜,再用无菌生理盐水清洗2次。
将完整胎盘置于1000ml无菌烧杯内,以无菌剪刀剪碎胎盘,收集从粉碎胎盘中流出的血液,称为胎盘血(U PB)。
将碎胎盘置于无菌不锈钢网上,用研钵棒一边研碎胎盘,一边用无菌生理盐水冲洗,收集从研磨后冲洗下的细胞,用滤网和注射器反复过滤数次,去除任何残留组织,离心用生理盐水洗2次,所收集的细胞称为胎盘组织细胞(U PT)。
细胞的长期培养在IMDM中加入20%的脐带混合血浆,10% 56℃灭活胎牛血清和1%(v ol/v ol)抗生素,制备成细胞培养液。
用该培养液调整UC B,UPB及UPT的细胞浓度为2×106/ml,以10ml分别加入25ml的培养瓶中,置于37℃,5%CO2孵育箱中培养。
每周半量换液2次,并每周做细胞计数和细胞活性检测。
贴壁细胞的传代培养以长期培养的相同方法把细胞置于25ml培养瓶中,每周换液2次。
待细胞贴壁并长满培养瓶底后,先用不含血浆的IMDM冲洗培养瓶2次,加入0.5%胰蛋白酶(trypsin)消化约5分钟,倒出胰蛋白酶溶液,加入细胞培养液,反复冲洗粘于培养瓶壁上的细胞,离心清洗1次,调整细胞的浓度为2×106/ ml,加入到另1个25ml培养瓶中,置于37℃,5% CO2孵箱中继续培养。
统计学分析应用计算机软件:Stat View(Abacus Concepts, Berkeley,CA,USA)计算分析。
每个数值均计算出平均值和标准差,采用t检验的方法。
结 果细胞活性的比较检测不同时间和不同温度对这些细胞的影响。
表1比较在同样的抗凝剂(CPDA21),同样的细胞浓度(2×106/ml)分别在4℃和25℃(室温)下细胞的活性和计数,表明U PB和UCB在同样的条件下具有同样的细胞活性,而U PT在开始时间活性较UCB为低,但这个细胞活性和计数并不随着温度和时间而有所改变。
说明活性低是由于研磨时的细胞损伤,而活性好的细胞并不会随时间和温度改变而死亡。
T able1 I nfluence of time and temperature on survival of nucleated cells in UCB,UPB and UPTCell typeTime(hours)TemperatureViability(%)Nucleated cells(×10-6)UCB 03 4℃ 100 225℃100 1.884℃100225℃100 1.7U PB04℃100225℃100 1.884℃100 1.825℃1002U PT04℃75225℃80284℃75 1.925℃752 3:immediate test after cell harvest.UCB:umbilical cord blood.U PB:umbilical placental blood.U PT:umbilical placenta tissue CD34+及有核细胞数目共收集5个胎盘及相应的脐血,从收集到处理・341・胎盘组织及血液中含有丰富的造血干/祖细胞细胞的平均时间为6小时,最长的为18小时。