4、产物表达形式
• 不溶性蛋白质：细胞质内形成包涵体 • 可溶性蛋白质：存在于细胞质 • 周质表达：外源蛋白被运输分泌到周质空间，可溶性 • 胞外表达：胞内可溶性蛋白质分泌到培养液中
5、大肠杆菌表达系统的问题 缺点:
1）缺乏翻译后修饰，如糖基化
2）常形成包涵体，复性效果差
3）蛋白质易被降解 4）内毒素难以除尽，产生热源 5）N端增加的蛋氨酸容易引起免疫反应 优点: 1）简单，经济，快速
酿酒酵母发酵产生乙醇，制约了高密度发酵 修饰的蛋白质糖基化侧链过长，会引起副作用
4、应用
• 1981年，Nature，Hitzeman等在酵母中表达人干扰素 • 激素类：67种人胰岛素及1种突变体，尿酸水解酶和水蛭素
6.1.1 大肠杆菌系统
1、大肠杆菌（Escherichia coli）形态特征
细胞：G-，单细胞，杆状，鞭毛，无芽孢，一般无 荚膜。裂殖。
菌落：白色至黄白色，光滑，直径2~3mm
• 2、生化与遗传特性
能在仅有碳水化合物和氮、磷及微量元素的无机盐 的极限培养基上生长，发酵糖，产气、产酸。 繁殖一代约17min 基因工程中使用菌株：K-12株的衍生菌株 基因组：4.6 Mbp，3000多种蛋白质 染色体DNA为环状双链，核外遗传物质为质粒
12. 琼脂糖电泳 13. 蛋白质纯化
14. SDS-PAGE 15. 微生物发酵技术 16. 动物细胞培养技术 17. 熟悉DNA分析软件 18. 熟悉分子生物学常用网站
基因工程菌
• 概念：以微生物为操作对象，通过基因工程技术获得的表达外源基 因，或过量表达或抑制自身基因的工程生物体。
• 种类： 基因工程大肠杆菌和酵母：重组蛋白质药物 基因工程技术改造出发菌：氨基酸、抗生素、甾体激素、中间体生 产
表达载体—穿梭载体
• 含有复制起始序列或整合序列、选择标记以及由启动子、终止子和 信号肽序列构成的表达盒序列。
• 四种类型
YIp酵母整合载体 YCp酵母着丝粒载体 YRp酵母复制载体 YEp酵母附加载体
• YIp酵母整合载体：选择标记和MCS，无自主复制序列，
有整合序列。同源重组整合到酵母染色体，随同染色体一 起复制和遗传。
• YEp酵母附加载体：复制子，可自主复制，高拷贝，转
化频率高。改造后，无需选择压就能高拷贝稳定分配，在 大规模无选择培养中是非常有用的，用于过量表达外援基 因。
3、优点与不足
• 载体：安全、无毒 • 营养缺陷选择外来质粒 • 培养条件简单，大规模培养技术成熟 • 亚细胞器分化，进行蛋白质的翻译后正确修饰和加 工，并具有良好的蛋白质分泌能力 • 缺点：
• YCp酵母着丝粒载体：着丝粒序列和自主复制序列。可
自主复制，拷制载体：酵母基因组DNA复制序列，可独立
自主复制，转化效率高。但存在分配不均一性，母细胞中 远远多于子细胞中。无选择压，容易丢失。常用于试验研 究，很难工业化应用。
2）适合于制备抗体，供下游研究
பைடு நூலகம்、应用
• 大量外源基因能超量的表达，18种药物上市 • 多肽类：2种（甲状旁腺激素1-34、利尿钠肽） • 激素：胰岛素及2种突变体、8种生长素（1种PEG 化）
• 细胞因子类：5种干扰素α（1种PEG化）、干扰素β 和γ，2种G-CSF（1种PEG化）、白介素-2、白介素11、白介素-1拮抗剂 • 溶栓酶类：rPA（reteplase，瑞替普酶） • 白喉毒素-1L 2融合蛋白、OspA脂蛋白（疫苗）等
生物制药工程
第六章 基因工程制药工艺
• 6.1 基因工程制药微生物表达系统 • 6.2 基因工程大肠杆菌的构建 • 6.3 基因工程菌的发酵培养与控制
基因工程药物生产的基本过程
基因工程药物的生产分为上游和下游两个阶段： 上游阶段：实验室内完成
克隆目的基因 目的基因的表达
下游阶段：将实验室的成果产业化、商品化 工程菌大量培养 产品的分离纯化和质量控制。
6.1.2 酵母表达系统
1、形态特征
细胞：单细胞真核生物，球形，椭圆形，卵形 繁殖：芽殖、裂殖，在特定条件下才产生子囊孢子 菌落：乳白色，有光泽，边沿整齐
2、生长与遗传特征
• 两个性别不同的单倍体细胞结合形成二倍体结合子 或营养细胞，进行芽殖。 • 能发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖等。 • 生长繁殖迅速，倍增期约2 h • 酿酒酵母有17条染色体 • 1996年完成其全基因组测序，遗传背景相对清楚 • 基因组：120.68 Mbp，5887个ORF，编码约6000个 基因
3、质粒载体
选择标记 复制子
多克隆位点
质粒载体的基本特征
• 自主复制性：复制子—复制起始点及控制复制频率的调控 元件。质粒DNA不依赖于染色体DNA而自主复制。 • 选择标记：质粒编码的选择标记，产生一种新的表型， 用于转化体的筛选。如：抗生素抗性基因，氨苄、四 环素、卡那等。 • 多克隆位点：外源基因插入载体的位置，由多种常见的 限制性内切酶位点序列构成。 • 不相容性：具有相同或相似复制子结构及特征的两种不 同质粒不能稳定地存在于同一宿主细胞内。 • 转移性：通过细菌接合作用从一个宿主转移到另一个宿 主细胞/菌
基因工程药物研究的技术路线-上游技术
目的基因克隆 酶切
质粒提取、酶切 连接、转化
PCR筛选，酶切确认，提取质粒测序
转化宿主细胞 诱导表达
分离纯化目的蛋白
基因工程药物涉及的技术
1. RNA提取及操作, 防RNA酶 2. 引物设计 3. cDNA合成
4. PCR 5. 质粒提取 6. 限制性内切酶操作 7. DNA连接 8. 制备大肠杆菌感受态细胞 9. 转化大肠杆菌 10. 无菌操作 11. 制备各种培养基
质粒类型
• 严谨型质粒：每个细胞含少数拷贝质粒 • 松弛型质粒：每个细胞含几十至几百拷贝质粒 • 克隆质粒：用于克隆和扩增外源基因 • 测序质粒：用于基因测序 • 整合质粒：用于外源基因与宿主染色体整合 • 穿梭质粒：能在两种宿主细胞存在 • 表达质粒：能表达基因产物
表达载体MCS附近结构
1.启动子 2.操纵子 3.核糖体结合位点 4.MCS 5.终止子