的片段 – 将这些片段混合，进行无引物PCR – 加入DNA连接酶，使DNA小片段重新连接，可能获得
有价值的新组合 – 通过合适的表型筛选系统进行选择
• 这种方法甚至能够改变酶分子的底物特异性，还可 以实现酶的稳定性及催化活性的改良。
DNA shuffling
Reshuffle
一组相关的基因
DNase I 随机切割
N MLLQAFLLAGFAAKISA S
• 信号肽的重要性就在于它是蛋白质向细胞外分泌的 充分必要条件，因此研究人员开发了一系列利用信 号肽进行蛋白分泌表达的载体。
• 细菌中B. subtilis 是理想的蛋白质分泌生产宿主，酵 母S. cerevisiae、P. pastoris和曲霉属的霉菌则是比较
• 这种能够改变蛋白质的功能，或者设计和创造具有 某种功能的新蛋白的技术被称为‘蛋白质工程’。
• 蛋白质工程的终极目标：
① 根据氨基酸序列正确预测蛋白质的结构与功能; ② 使用天然或非天然氨基酸甚至化学合成的分子自由地
创造具有期望结构和功能蛋白质。
蛋白质工程
• 从实际应用来看，酶、抗体、受体、运输蛋白、信 号转导蛋白、转录因子等均可以成为蛋白质工程的 改造对象。
• 先将该序列导入目标基因中想要导入该氨基酸的位 置，同时用‘化学酰胺化’的方法得到该氨基酸的 氨酰tRNA，使携带识别CGGG的反密码子的tRNA 与非天然氨基酸结合。
Ser
tRNA UCG
AGC ·AGC ·ACC
mRNA
硝基苯丙氨酸 (化学酰胺化法）
GCCC AGC ·CGGG ·ACC
在体外无细胞翻译体 mRNA 系中进行蛋白质合成
洗涤剂用酶
• 洗涤剂用酶是洗涤剂中不可或缺 的成分，常添加的酶包括蛋白酶、 淀粉酶、脂肪酶等。其市场需求 量在不断增加。
• 在各种酶制剂联合使用以提高洗 涤效果的同时，科研人员也致力 于通过蛋白质工程手段改善每种 酶的功能。
• 蛋白酶：蛋白酶是洗涤剂中最重 要、使用量最大的酶制剂。
洗涤剂用酶
• 在长期保存的过程中，洗涤剂中的漂白成分会引起 酶的失活，可能是由于位于活性中心附近的Met被 氧化所引起。
• 因此在实际生产中，更多使用的是那些仅在需要时 才进行强力表达的诱导性启动子。
• E. coli的诱导表达系统几乎全部是利用E. coli 来源 的各种操纵子中的启动子，如lac启动子。
E. coli 的乳糖操纵子lac operon
P lac I
调节基因
启动子
Plac O
操纵 基因
lac Z
lac Y
适合作分泌蛋白生产的真核生物宿主。
宿主的蛋白降解系统
• 影响蛋白质表达量的一个重要的宿主因素是宿主本 身的蛋白酶的作用，应对的策略之一是寻找相应蛋 白酶缺陷的突变株。
• 如E. coli BL21（DE3）是基因表达实验中最常与
pET系列质粒配合使用的宿主菌，B株系天然缺失 lon蛋白酶（K12有）。研究人员又向其引入了蛋白 酶OmpT的缺失突变，有利于提高蛋白产量。
UAS TATA
启动子
• 根据表达的方式可以把启动子分为两类：
– 构成性表达启动子：持续表达 – 诱导性表达启动子：只在诱导条件下表达。
宿主
大肠杆菌E. coli
枯草芽孢杆菌
酿酒酵母S. cerevisiae
启动子
构成性表达
诱导表达
lac, tac, ara pBAD, λPL, T7
蛋白酶、淀粉酶基因 的启动子
savinase的基因进行定点板，进行低温条件下的 酶促反应。获得的突变型酶在15℃时的洗涤效果有 显著提高（Kannase®，Novozymes，1997）。
• 淀粉酶：大量用于餐具的自动化清洗。来源于B. licheniformis 的α-淀粉酶性能优良，但是不抗氧化剂。
• 以融合蛋白形式进行表达的
额外的好处是可以对目标蛋
ampr
表达载体
白进行亲和层析纯化，能大 大简化蛋白的纯化过程。
ori
融合蛋白的亲和层析法纯化
GST
树脂颗粒
GST
结合
谷胱甘肽硫转移酶 谷胱甘肽，GSH 目标蛋白
GST
GST
洗脱
GST
GST
蛋白酶
蛋白质工程
• 随着科学家对蛋白质的结构与功能之间关系的认识 更加深刻，到1980年前后科学家们已经可以根据不 同的目的来设计和创造突变蛋白质分子。
• 原核基因的启动子主要包括-35和-
10区，真核基因启动子则主要是
TATA盒与一些上游转录活化序列 UAS。这些序列被称作顺式作用
真核基因启动子
元件（cis序列）。
RNA聚合酶
• 一般认为启动子的强度与cis序列 的最佳配置相关，在人工构建强 启动子时主要是尝试把不同基因 的启动子的cis序列进行重组。
• 如果把该Met替换为其他氨基酸，可以提高酶分子 的抗氧化性能。
• 例如：来源于芽孢杆菌的一种碱性蛋白酶，将其 Met222替换为Ala后，经100mM H2O2处理15min后残 余活力由野生型的30%提高到70%。（诺维信 Novozymes的产品Esperase®。）
洗涤剂用酶
• 低温蛋白酶的开发：对B. clausii 来源的蛋白酶
启动子 SD
目的基因
终止子
• 当对特定基因进行强力表达时，转录可能会波及该 基因的下游区域，既会给宿主带来额外负担，也会 使质粒的稳定性下降。
• 因此为了提高生产性能，往往会在目的基因下游添 加终止子序列。如E. coli中的rRNA基因rrnB的终止 子、T7噬菌体的终止子等。
密码子使用频率
• 不同物种对各种密码子的使用频 率不同，原因之一是细胞中各种 tRNA分子所占的比例不同。
ampr
lacZ’
• 在以E. coli为宿主的生产中，常使 用可以根据培养温度调整拷贝数的 runaway质粒（如pCP3），42 ℃时 拷贝数最高可达几千个。
复制起点ori
启动子的强度
• 启动子的强度是指一个启动子能 够多大程度地结合RNA聚合酶并 引发转录过程。
原核基因启动子
RNA 聚合酶
-35 -10
• 在目前，从头设计具有全新的结构和生物功能的蛋 白质分子相当困难，更多的工作是对现有蛋白质的 改造。蛋白质改造的技术主要有：
① 随机突变法 ② 定点突变法 ③ DNA shuffling ④ 非天然氨基酸导入 ⑤ 基因融合
蛋白质改造技术
• 随机突变法是创造在基因水平上的多样性的重要技 术，包括：
混合这些片段，热变性， 退火（shuffle）
表型筛选
DNA聚合酶，连接酶嵌合体蛋白质改造技术• 非天然氨基酸导入：将20种氨基酸之外的氨基酸 （如硝基苯丙氨酸）导入蛋白质分子中，可以赋予 蛋白质全新的功能。
• 首先必须使一些遗传密码子对应于非天然氨基酸， 通常需要对常规的三联体密码子进行扩展，产生 ‘四联体密码子’，如CGGG。
• 外源蛋白质在宿主菌中表达 时可能会遇到细胞毒性问题， 另一些蛋白则可能因过剩表 达而形成不溶性的包涵体。
• 采用细胞外分泌的方法生产 是避免上述情况发生的有效 手段。
• 分泌至细胞外的目的蛋白不 乳酸克鲁维酵母 仅可以正确折叠，而且表达 量较高，并有利于分离与精 制。
信号肽
• 信号肽位于分泌蛋白质的N-末端，由15~30aa组成， 末端还存在一段可被信号肽酶切断的序列。如：酵 母蔗糖酶信号肽：
PCR进一步扩增 连接到克隆载体中，转化E. coli，挑选克隆，提取质粒，测序
蛋白质改造技术
• DNA shuffling：由Stemmer等人所建立，作为一种 基因重排的方法，主要步骤：
– 针对某个蛋白质构建数个经过功能改良的突变基因 – 用DNase I将这些DNA随机切断，获得长度在20~50bp
蛋白质改造技术
• 定点突变法：针对编码某个蛋白质的基因，在特定 位点引入突变的方法。操作过程如下：
1. 人工合成带有需引入的突变序列的寡核苷酸（突变引 物，如：Val→Arg）
2. 制备目标基因的单链DNA模板
3. 使突变引物与DNA模板退火
4. 使用DNA聚合酶、连接酶一起合成全长基因，引入 突变
• 另一种策略是将目的蛋白与其它已知蛋白（如GST， 谷胱甘肽硫转移酶）通过基因融合的方法进行融合 表达，也能适度避免目的蛋白质的降解。
融合蛋白表达
• 蛋白质的在结构与功能上 都具有模块化的特点，其 结构域往往在结构和功能 上都有相当的独立性。
基因A
ORF
ORF
• 这就使通过DNA重组技术 产生融合蛋白质成为可能。
蛋白质改造技术
• 将上述氨酰tRNA与目标基因的mRNA分子共同添加 到无细胞翻译体系中，就可以获得想要的蛋白质。
• 使用多种四联体密码子，可将2种以上的非天然氨 基酸分别导入蛋白质分子中特定的位点。
• 这种技术存在的问题主要有：
– 因为使用无细胞翻译系统，所以蛋白产量低 – 氨酰基tRNA的制备过程复杂 – 导入非天然氨基酸后的蛋白质发生变性、失活等
ADH1，TDH3
GAL1，PHO5
毕赤酵母P. pastoris
GAP
AOX
诱导性表达
• 强力启动子的优点是表达的蛋白质多，但是随着 mRNA和蛋白质的大量合成与积累，反而会阻碍细 胞的生长，或激活宿主的蛋白质降解系统。
• 这都会造成目的蛋白产量的下降。如果目的蛋白对 宿主细胞有毒性的话就更是如此。
• 这种技术在实验室中也常 被用于目的蛋白的亲和层 析纯化（例如：与GST、 His标签、GFP等蛋白融 合）。
mRNA 融合蛋白
基因B
ORF
基因融合
ORF