电穿孔法转染人树突状细胞条件的优化(作者：___________ 单位： __________ 邮编：___________ )作者：单铁英苏安英唐军民【摘要】目的：通过电穿孔法将带有增强型绿色荧光蛋白基因(enhan ced gree n fluoresce nt protein EGFP )的真核表达载体plRES2-EGFP( IRES2 in ternal ribosome en trysite 2 内部核糖体进入位点2)质粒导入未成熟树突状细胞( Immature Den driticCell,imDC)，探讨不同电穿孔条件对imDC电转染率和存活率的影响。
方法：通过密度梯度离心法分离人外周血单核细胞，采用细胞因子体外培养诱导其成为imDC在大肠杆菌中扩增plRES2-EGFP质粒，选择不同的电压、脉冲时间、细胞浓度、DNA剂量等。
应用电穿孔仪将PIRES2-EGFP质粒导入未成熟树突状细胞，荧光显微镜下和光镜下分别计算绿色荧光阳性细胞数和总细胞数。
0.4%锥虫蓝(trypan blue) 染色，计数电转染后细胞存活率。
结果：当imDC浓度为5X 106/mL 与6卩g DNA质粒混合，设定电转染仪电压为300 V、脉冲时间为500 卩s时,其电转染率到最高，细胞存活率最高，转染后24 h明显表达，48h后表达最强。
结论：在适当的电压、脉冲时间下，选择适当的细胞浓度、DNA剂量，在转染后的一定时间范围内，电穿孔法转染imDC可使目的基因获得较高的转染率，且细胞死亡最少。
电转染提供了外源基因转染imDC的可行技术。
【关键词】电穿孔转染绿色荧光蛋白树突状细胞Abstract Objective:plRES2-EGFP was successfully tran sfactedinto immature dendritic cells by means of electroporation in order to investigate the effect of electransfection efficiency and survival rate of immature dendritic cells in different con diti ons.Methods:M ono cytes obta ined form huma n peripheral blood by density guadient centrifugation are induced into imDCs in the presenee of cytokines in vitro.plRES2-EGFP was amplified inE.coli.imDCs were tran sferred with pIRES2-EGFP by means of electroporati on with differe nt electric voltages,times of impulse,cell concen trati onsand the doses of DNA.Numbers of green fluorescence positive cells and the total cell number were coun ted respectively un der fluoresce nt microscope and visible light microscope.the cells were stained with 0.4% trypan blue,electransfection efficiency and the cell survivalrate were counted.Results:Electransfection efficiency wasin creased to the highest value whe n imDCs with theconcentration of 5X 106 cells/mL were mixed with 60 卩g-total DNA,the electric voltage of electroporation apparatus was set at 300V,and the time of impulse was 500 卩s.There wassig ni fica nt and the highest expressi on of plRES2-EGFP respectively at 24 h and at 48 h after tran sferri ng.C on clusio n:A higher tra nsfecti on efficie ncy of target genes can be obta ined by means of electroporati on with suitable electric conditions.Electric transfection provides atech ni cal possibility to make DNA into imDCs.Key words Electroporati on; Tra nsfect;Gree n fluoresce nt protein;Dendritic cell;Human树突状细胞（dendritic cell,DCs ）作为体内惟一能活化初始T细胞的抗原递呈细胞（antigen presentingcell,APC），是激发机体特异性免疫反应的关键，其在抗肿瘤免疫治疗领域中的作用受到广泛关注，以DCs为基础构建的各种类型的疫苗在多种肿瘤免疫治疗的基础和临床研究中显示了旺盛的生命力和良好的前景[1,2] 。
本研究应用电穿孔仪将plRES2-EGFP质粒导入未成熟树突状细胞，探索外源基因转染imDC的优化条件。
1材料与方法1.1材料与器材PIRES2-EGFP质粒（Clontech 公司）、Wizard 质粒抽提试剂盒（Promega公司）,Hinc H酶（Takara公司）。
健康人新鲜外周血，购自北京市血库。
RPMI-1640培养液，美国GIB公司产品。
淋巴细胞分离液（Ficoll ，1.077 g/mL ），上海试剂二厂产品。
胎牛血清（FCS，新生牛血清（NCS）,美国HYClone公司产品。
重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF和重组人白细胞介素 4 (rhlL-4 ),肿瘤细胞坏死因子a(TNF-a)、购自德国RD公司产品。
电转染仪BTX-830, 购自北京基因公司。
1.2质粒的制备及鉴定将plRES2-EGFf质粒转化感受态TOP1(大肠杆菌，取菌液20卩L接种到5 mL含100卩g/mL卡那霉素的LB培养基中。
在37 C摇床上剧烈震荡培养过夜。
按照Wizard质粒抽提试剂盒说明书用碱裂解法提取、纯化质粒DNA紫外分光光度测OD260nm： OD280nm=1.8,证明质粒纯。
测浓度为0.4卩g/卩L,保存于-20 C备用。
取少量质粒用Hine H 酶切，0.9%琼脂糖电泳鉴定酶切结果，验证该质粒是否确为pIRES2-EGFP1.3 imDC的获取取正常人新鲜外周血200 mL,以淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(PBMN)在37 C和5%CO饱和湿度条件下培养2 h，取贴壁细胞即单核细胞(pDC，并测其纯度，调整细胞浓度为2X 106/mL加入RPMI-1640液、10呱台牛血清(FCS和细胞因子rhGM-CSF(1 000 U/mL); (rhIL-4)500 U/mL 于37 C和5%CO饱和湿度条件下培养。
第7 d收获的细胞为imDC用免疫细胞化学的方法显示细胞表面共刺激分子CD80 CD86及HLA-DR计数阳性细胞。
1.4电穿孔法转染树突状细胞1.4.1不同电压条件下转染imDC根据北京基因公司提供参数及操作程序将PIRES2-EGFP质粒转入imDC选择脉冲时间下400卩s，细胞浓度i x 106/mL、DNA剂量2卩g不变，电压分别为200 V、300 V、400 V条件下进行瞬间和稳定电转染。
电穿孔缓冲液为RPMI-1640培养液；电转杯体积0.8 mL，将0.4 mL细胞悬液与plRES2-EGFp质粒混合均匀进行电转染，电穿孔后30 min加入含20%胎牛血清的RPMI-1640培养液，置37 C、5%CO培养箱中培养，同时以未转染的imDC为空白对照。
1.4.2 不同脉冲时间下转染imDC选择电压为300 V，细胞浓度1X 106/mL、DNA剂量2卩g不变，脉冲时间400卩s、500卩s、600卩s条件下进行瞬间和稳定电转染。
其余操作同前。
1.4.3 不同DNA剂量下转染imDC选择电压为300 V，细胞浓度1 X 106/mL、脉冲时间500卩s不变，DNA剂量分别为4卩g、6 g、8 [1 g 条件下进行瞬间和稳定电转染。
其余操作同前。
1.4.4 不同imDC浓度下进行转染：选择电压为300 V、DNA剂量为6 i g、脉冲时间500 i s不变，细胞浓度分别为1X 106/mL、5X106/mL、8X 106/mL条件下进行瞬间和稳定电转染。
其余操作同前。
1.4.5 电转染率观察及存活率观察：电转染后，细胞涂片在荧光显微镜的可见光下固定1个视野，计数细胞总数，然后转换荧光光源，计数发出绿色荧光的细胞，计算电转染率。
电转染率=(发出绿色荧光的细胞数/可见光下总细胞数)X 100 于电穿孔后，0.4%锥虫蓝(trypan blue)染色，计数电转染后细胞存活率。
2 结果2.1 pDC纯度及imDC阳性率：pDC的纯度为90% imDC的阳性率为80%2.2免疫荧光显微镜下显示电转染后imDC细胞内GFF荧光（见图1）。
2.3用荧光显微镜观察不同的电压plRES2-EGFf质粒在imDC中的表达率及细胞存活率，见表1。
随着电压的升高，表达率增强，以300 V 时最强，超过300 V后表达率有所下降。
细胞存活率在48 h时超过70%点随着电压的升高和时间的延长，imDC死亡率升高。
表1不同电压时不同时间plRES2-EGFf质粒在imDC的表达率2.4用荧光显微镜观察不同的脉冲时间plRES2-EGFP质粒在imDC中的表达率，见表2。
随着脉冲时间的延长，表达率增强，以500 11 s 时最强，超过500 i s后表达率有所下降。
细胞存活率在48 h时超过70%点随着电压的升高和时间的延长，imDC死亡率升高。
表2不同的脉冲时间时不同时间plRES2-EGFf质粒在imDC的表达率2.5用荧光显微镜观察不同的DNA剂量plRES2-EGFP质粒在imDC中的表达率，见表3。