REPRODUCTION & BREEDING繁殖育种2018·9奶牛胚胎移植技术研究进展薛洁1,2，刘文浩1，吕湾2，杨海昱2，杨凌2，李荣岭1，李建斌1，仲跻峰1（1.山东省农业科学院奶牛研究中心，济南 250131；2.河北工程大学，邯郸 056001）中图分类号：S858.23 文献标识码：A 文章编号：1004-4264（2018）09-0022-05DOI: 10.19305/ki.11-3009/s.2018.09.006摘 要：胚胎移植技术是一项能够充分发挥优秀母畜繁殖潜力的技术。

本文概述了奶牛胚胎移植技术的研究进展，包括超数排卵、胚胎收集、胚胎移植、胚胎冷冻保存、体外胚胎培养、胚胎分割、胚胎活检和性别鉴定以及胚胎克隆。

关键词：超数排卵；胚胎移植；胚胎分割；胚胎性别鉴定胚胎移植（ET）是提高动物繁殖力的一种有效方法。

虽然母牛的胚胎移植不能体现出公牛的遗传潜力，但可以让母牛生产更多的后代，比一年一次的自然分娩更能发挥优秀母牛的作用。

1890年，Heape将2个四细胞时期的安哥拉兔胚胎移植到一只受精的比利时兔输卵管中，产下了4只比利时和2只安哥拉幼兔[1]，这是第一次成功移植哺乳动物胚胎。

目前，结合活体采卵（OPU）、体外受精（IVF）和ET的体外胚胎生产已经发展成为一种替代传统超排和ET的方法。

而胚胎冷冻、储存等技术使得在国际间运输胚胎、防止某些传染病传播、青年牛提前受孕产犊成为可能，还可以在移植前进行胚胎评估（如遗传价值或遗传疾病等）。

1 超数排卵ET通常从超数排卵开始。

Casida等首先开展了牛的超数排卵研究[2]，后来，英国剑桥农业研究委员会的Rowson等开发了使用孕马血清促性腺激素/马绒毛膜促性腺激素（PMSG）诱导超排的方法[3]。

由于PMSG半衰期长，只需要注射一次就可达到超排的目的，但发现经常回收到不成熟的卵泡和低质量的胚胎，超排效果相当不稳定。

Dziuk等研究了利用促卵泡素（FSH）进行超数排卵的方法[4]。

给母牛每天注射2次FSH，连续注射4d，可获得更一致的超排结果[5]。

多年来，商业化ET程序已形成，一般牛在发情的第8~13天注射FSH，而同期发情方案使超排更容易、方便。

最近有报道指出，使用透明质酸作为稀释剂注射1或2次FSH的超排效果，与用盐水作为稀释剂多次注射FSH的超排效果一致[6,7]。

超数排卵的一个显著特征是动物对促性腺激素处理的反应不一致。

在牛上使用类似的超排方案，可以回收0~100个卵母细胞，其中优质胚胎有0~60个。

过去的25年里，牛超排获得胚胎的平均数量变化不大。

美国胚胎移植协会（AETA）报告指出，1998~2010年，肉牛超排获得胚胎的平均数（7.1个/次）比奶牛（6.2个/次）略多一些。

实际上与Looney报道的2.000多头肉牛超排获得的胚胎平均数（6.2个/次）和Hasler等报道的600多头荷斯坦牛超排获得的胚胎平均数（6.4个/次）没有差异。

2 胚胎收集最初，收集牛胚胎需要进行手术。

手术具有侵入性、费用高、耗时长的缺点，且需要专门技术人员及复杂的手术设施，并且不能在农场现场进行。

此外，奶牛收稿日期：2018-01-30基金项目：国家奶牛产业技术体系建设专项经费（CARS-36）；山东省农业科学院农业科技创新工程（CXGC2016A04）；山东省农业良种工程（2016LZGC027）；山东省自然基金面上项目（ZR2016CM37）。

作者简介：薛洁（1996-），女，硕士生，研究方向为奶牛育种；刘文浩（1972-），本科，副研究员。

两人为共同第一作者。

通讯作者：李建斌，博士，研究员；杨凌，博士，教授。

REPRODUCTION & BREEDING繁殖育种2018·9原因可能是发生了布鲁氏菌病。

20世纪70年代，牛胚胎几乎全部通过中线切口手术法移植，并且与手术采集胚胎的缺点相似。

加拿大魁北克省MeGill大学Baker开发了一个相对简单的侧腹部移植手术，并很快应用于农场。

该方法在美国的大规模ET中证明是非常成功的，怀孕率可超过70％[12]。

然而，侧腹手术移植并不理想，因为使用该方法包括固定牛只和术前腰椎区局部麻醉，再手术打开侧腹部，然后在无菌条件下找到子宫角，通过子宫角穿刺移植胚胎，最后缝合切口。

非手术法移植的研发得益于定时人工授精技术（AI）的发展。

供体和受体同步发情对于成功的ET来说非常重要，还可以减小受体牛群的大小。

在一项研究中[12]，前列腺素诱导发情的受体与自然发情的受体相比，妊娠率略有上升。

发情不同步会影响鲜胚和冻胚的怀孕率，在24h内同步对怀孕率没有显著影响，胚胎移植从手术转为非手术移植，妊娠率没有明显的下降[13]。

非手术ET的一个早期问题是没有使用特定的设备，1984~1985年IMV公司引入了针对非手术ET的设备后，使不同鲜胚移植方案的妊娠率相近。

然而，相对于手术法，成功的非手术法需要更多的经验，特别是丰富的直肠触诊经验[10]。

4 胚胎冷冻保存尽管Polge等首次报道了精子冷冻保存成功，但冷冻胚胎会100％死亡。

胚胎比精子含有更多的水分，所以有效脱水至关重要，这可以防止冰冻对胚胎的伤害。

直到1972年，小鼠胚胎冷冻保存成功[14]。

1973年首次报道了牛胚胎冷冻保存成功[15]。

同冷冻精子一样，最佳冷却速率也适用于冷冻胚胎。

最佳冷却速率取决于细胞含水量和易脱水程度。

由于早期胚胎细胞非常大，所以冷却速率就要非常慢（<1℃/min）。

系统地比较降温速率、升温速率和不同防冻剂的使用效果后发现，以-0.5℃/min的速率将胚胎从-5~7℃冷却到-30~-35℃，可使水有足够的时间渗出细胞，而不会形成破坏性的细胞内冰晶。

之后的改进是在细胞过脱水前，将冷却的胚胎（-30~-35℃）投入液氮，还要以最小化渗透肿胀的方式从细胞中除去冷冻保护剂[16]。

1976年英国向新西兰出口牛冷冻胚胎，此举证明对于有价值遗传物质的国际交换来说，胚胎冷冻保存无可替代。

的泌乳使胚胎回收或转移难以顺利进行，而对个别动物的反复手术往往使卵巢发生粘连等疾病。

非手术回收对于ET实践者和动物来说更简单，且成本相对较低。

最初Rowson和Dowling [8]在剑桥研发了非手术法。

他们制造了一台用于从活体中采集胚胎的设备，该设备有一个带有充气口的导管，可以穿过子宫颈冲洗子宫角。

Minnesota大学的Dziuk等[4]和日本的Sugie [9]也报道了非手术采集胚胎的技术。

Drost等和Rowe等报道了使用Foley导管的进展。

此后，商业ET使用该技术的数量迅速增加。

非手术采集牛胚胎通常要使用大量的冲洗液（500~2000mL）来冲洗子宫。

这种冲洗液通常被收集在一个1L的量筒中，30min或更长时间后，胚胎将沉降到底部。

然后丢弃大部分冲洗液，在剩下的100mL中检索胚胎。

20世纪80年代中期，研究了几种胚胎过滤器模型，其中最好的一个开发成商品。

过滤器可以连接非手术冲洗设备的流出管，然后用冲洗液可通过的不锈钢或尼龙筛将胚胎封入塑料杯中，缩短了检索卵子和胚胎的时间，非常方便。

在商业化产品出现前，大多数ET研究者均使用自己制作的培养液。

通常使用含有1％的热处理过的新生小牛血清改良Dulbecco's.PBS进行冲洗，而使用10％新生小牛血清来保存胚胎[10]。

现在，一些公司制造并销售专门用于冲洗、保存、转移和冷冻保存的培养液。

这些培养液一般不含血清，但牛血清白蛋白（BSA）是常见的成分。

经证明，不含生物来源成分且不需要冷藏的合成培养液也是有效的[11]。

尽管牛胚胎发育到7d时进行冷冻保存最佳，但通常在发情后6~8d收集，胚胎处于桑葚胚后期到囊胚阶段。

显微镜评估包括确定发育阶段（特别参考收集当天）、胚胎结构、卵裂球的外观形态、分化程度和其他退化迹象等。

胚胎质量的描述性定义最早由Elsden等提出，目前仍然作为胚胎质量评估的基础。

牛胚胎的质量评价是Robertson和Nelson基于形态学提出的，现在国际上已经认可。

3 胚胎移植1949年，Umbaugh报道了在德克萨斯州进行了牛的胚胎移植，并且4头受体牛妊娠，但后来全部流产，REPRODUCTION & BREEDING繁殖育种2018·9现今，胚胎冷冻保存是ET程序的重要组成部分。

事实上，美国约有70％的牛胚胎被冷冻，而不是在收集后立即转移。

冷冻技术可以使胚胎一次性收集，然后在另一个合适的时间、地点，根据确切的受体数量进行移植。

20世纪80年代早期，二甲基亚砜是最常用的冷冻保护剂，后来被甘油取代，随后乙二醇作为冷冻保护剂被迅速而广泛地接受[17]。

直接移植就是将细管解冻并放置在ET枪中。

在直接移植之前，先将胚胎解冻，然后用蔗糖将胚胎复水，并重新装入细管进行移植。

使用乙二醇法直接移植对ET产业发展具有积极影响。

Hasler报道，从鲜胚移植转为冻胚移植，妊娠率会降低10%~13%[13]。

Hasler认为胚胎发育阶段也是影响冻胚移植是否成功的重要因素，从73.000次的移植数据得出：晚期桑椹胚（4期）、早期囊胚（5期）、囊胚（6期）及扩张期囊胚（7期）的受胎率分别是53.7％、55.3％、52.1％和43.8％，6期和7期胚胎妊娠率显著低于4期和5期[18]。

5 体外胚胎培养IVF通常指组成胚胎体外生产（IVP）的所有步骤，包括体外成熟、IVF和体外培养。

1951年，Chang和Austin首次证明了兔和大鼠精子获能的必要性。

兔是第一个通过IVF产生后代的哺乳动物[19]。

然而，兔和小鼠的IVF程序最初并不能应用于牛。

Iritani和Niwa首次报道了牛IVF的成功案例，他们使用了发情期母牛输卵管、子宫或兔子宫中的获能精子[20]。

Newcomb等证明体外成熟的卵母细胞可以在牛输卵管中受精并生产小牛[21]。

1981年，第一头试管牛在Pennsylva-nia大学出生。

Critser等移植体外成熟-IVF的牛胚胎并成功分娩。

Hanada.等移植IVF胚胎，成功分娩了两头小牛。

1987年，在爱尔兰都柏林大学出生了第一批来自体外成熟、IVF和体外培养的小牛[22]。

整个80年代，牛体外胚胎生产技术仍然是主要的研究技术，但ET行业很少使用。

利用直肠超声波采卵的技术，通常称为OPU，已经成为活牛采卵的主要技术。

20世纪80年代，OPU和IVP的发展为商业ET方案奠定了基础[10]。

此期，另外两个重要发现为：一是39℃下的牛卵母细胞可更有效地进行IVF [23]；二是体外精子获能（使用肝素）的发展[24]。

美国利用OPU技术年生产胚胎的总量从2000年的2.000个增加到2015年的32.000个。