实验方案Gateway® 反应的基本原理∙BP反应—构建Gatew ay® 入门克隆∙LR 反应—构建Gatew ay® 表达克隆∙一管模式—从PCR 产物构建Gatew ay® 表达克隆∙Gatew ay® 载体转化—将您喜爱的克隆载体转化成Gatew ay® 载体TOPO® TA 克隆- 创建Gateway® 入门克隆∙∙步骤一–制备PCR 产物使用Taq 聚合酶和自己的方案生成PCR 产物。
通过最后7 到30 分钟的延伸步骤，结束PCR 反应。
步骤二- 进行TOPO® 克隆反应1. 按所示顺序使用试剂，以建立以下一种TOPO® 克隆反应。
对于电穿孔，将盐溶液稀释 4 倍以制备稀释盐溶液。
试剂化学转染电穿孔法新鲜的PCR 产物0.5 至 4 µl 0.5 至 4 µl盐溶液 1 µl --稀释盐溶液-- 1 µl无菌水至终体积为 5 µl 至终体积为 5 µlTOPO® 载体 1 µl 1 µl总体积 6 µl 6 µl∙2. 轻轻混合并在室温下孵育 5 分钟。
3. 置于冰上，然后开始转化One Shot® 化学感受态 E. coli，步骤如下步骤三- 转化One Shot® 化学感受态E. coli1. 每次转化时，解冻置于冰上的一小瓶One Shot® E. coli 细胞。
2. 在一小瓶One Shot® 化学感受态E. coli 中加入 2 µl TOPO® 克隆反应液，轻轻混匀。
3. 在冰上孵育 5 至30 分钟。
4. 将细胞置于42°C 下热休克30 秒，不振荡。
立即将试管转移至冰上。
5. 加入250 µl 室温S.O.C. 培养基。
6. 在37°C 下振荡孵育 1 小时。
7. 在预热的LB 琼脂平板上涂布10-50 µl 细菌培养物（琼脂平板含有100 µg/ml 大观霉素），并于37°C 下过夜孵育。
Gateway® 反应的基础知识∙∙∙∙BP 反应从含有att B 侧翼序列的PCR 产物到生成Gatew ay® 入门克隆只需 1 小时的简单反应。
参见下文的实验设置概述。
更多详细信息，请参阅说明书。
1. 在室温下向 1.5 ml 管中加入下述组分并混匀：attB-PCR 产物（=10 ng/µl；最终量~15-150 ng）1-7 µl供体载体(150 ng/µl) 1 µlTE缓冲液，pH 8.0 补充至8 µl2. 将BP Clonase™ II 酶混合物置于冰上约 2 分钟解冻。
对BP Clonase™ II 酶混合物稍微震荡两次（每次 2 秒）。
3. 对于每份样品（上述步骤1），向反应液中加入 2 µl BP Clonase™ II 酶混合物，稍微震荡两次以充分混匀。
进行短暂的低速离心。
4. 将BP Clonase™ II 酶混合物放回-20°C 或-80°C 储存。
5. 反应体系25°C 孵育 1 小时。
6. 向每份样品中加入 1 µl 蛋白酶K 溶液来终止反应。
稍微震荡。
在37°C 下孵育样品10分钟。
转化7. 取 1 µl 的各LR 反应液转化50 µl One Shot® OmniMA X ™ 2 T1 噬菌体抗性细胞（目录号C8540-03).冰上孵育30 分钟。
通过30 秒的42°C 孵育对细胞进行热休克。
加入250 µlS.O.C. 培养基并在37°C 震荡孵育 1 小时。
将20 µl 和100 µl 每种转化液分别涂布于选择性平板上。
注意：任何转化率达>1.0 × 10 8 转化子/µg 的感受态细胞均可以使用。
8. 取 1 µl pUC19 DNA (10 ng/ml) 转化50 µl 上述One Shot ® OmniMAX™ 2 T1 噬菌体抗性细胞。
在含100 µg/ml 卡那霉素或含供体载体的相应选择性标记物的LB 平板上涂布20µl 和100 µl。
预期结果如果转化并涂布全部BP 反应液，则高效的BP 重组反应将产生1500 个以上的菌落。
∙∙LR 反应将基因从Gatew ay® 入门克隆转移至目的载体只需 1 小时的简单反应。
参见下文的实验设置概述。
更多详细信息，请参阅说明书。
1. 在室温下向 1.5 ml 管中加入下述组分并混匀：入门克隆(50-150 ng) 1-7 µl目的载体(150 ng/µl) 1 µlTE缓冲液，pH 8.0 补充至8 µl2. 将LR Clonase™ II 酶混合物置于冰上约 2 分钟解冻。
对LR Clonase™ II 酶混合物进行两次短暂的漩涡震荡（每次 2 秒）。
3. 对于每份样品（上述步骤1），向反应液中加入 2 µl LR Clonase ™II 酶混合物，并通过两次短暂的漩涡震荡将其混合均匀。
进行短暂的低速离心。
4. 将LR Clonase™ II 酶混合物放回至-20°C 或-80°C 储存。
5. 反应体系25°C 孵育 1 小时。
6. 向每份样品中加入 1 µl 蛋白酶K 溶液来终止反应。
稍微震荡。
在37°C 下孵育样品10分钟。
转化按照BP的对应方案操作，不同的是需要在适合目的载体的LB 平板上使用选择性标志物（通常是100 µg/ml 氨苄青霉素）。
预期结果如果转化并涂布全部LR 反应液，则高效的LR 重组反应将产生5000 以上个菌落。
单管形式如果希望将两侧具有attB 位点的PCR 产物直接转移到表达克隆中，可以使用以下方案轻松的将BP和LR 反应结合在一起。
这样就避免了构建Gatew ay® 入门克隆时的转化和DNA 提取过程。
1. 在一个 1.5 ml 的微型离心管中，准备如下的15 µl BP反应体系：attB DNA (50-100 ng) 1.0-5.0 µlattP DNA（pDONR™ 载体，150 ng/µl）1.3 µlBP Clonase™ II 酶混合物 3.0 µlTE缓冲液，pH 8.0，最终体积为15 µl2. 在震荡器上稍微震荡，充分混匀反应混合物，然后于25°C 孵育 4 小时。
注意：根据需要，重组反应的时间也可以延长多达20 小时。
与仅孵育 1 小时相比，过夜孵育通常可多产生 5 倍的菌落。
对于较大的质粒(=10 kb) 和较长的PCR 产物(=5 kb)，推荐采用较长的孵育时间。
3. 从反应体系中取出 5 µl 移到另一管中，用以评估BP反应的效率（见下文）。
4. 向余下的10 µl 反应体系中加入：目标载体(150 ng/µl) 2.0 µlLR Clonase™ II 酶混合物 3.0 µl最终体积为15 µl5. 在震荡器上稍微震荡，充分混匀反应混合物，然后于25°C 孵育 2 小时。
注意：根据需要，重组反应的时间也可以延长多达18 小时。
6. 加入 2 µl 蛋白酶K 溶液。
于37°C 孵育10 分钟。
7. 用 1 µl 反应产物转化50 µl 相应的感受态 E. coli。
8. 然后涂板于含相应抗生素的LB 平板，以便筛选表达克隆。
评估BP 反应的效率1. 向由上述“单管”方案的步骤 3 得到的 5 µl 反应产物中加入0.5 µl 蛋白酶K 溶液。
于37°C 孵育10 分钟。
2. 用 1 µl 反应产物转化50 µl 相应的感受态E. coli。
涂板于含相应抗生素的LB 平板，以便筛选入门克隆。
∙∙Gatew ay® 载体转化(Gatew ay® Vector Conversion)将最爱使用的克隆载体组转化为Gatew ay® 载体是一种相当直观的方案，这种转化最终能简化克隆和表达过程。
如要将克隆载体转化为Gatew ay® 目的载体，需要：1. 根据需要选择合适的阅读框盒。
2. 利用选择的限制性内切酶，使要转化的载体线性化。
0如果使用的限制性内切酶会产生突出末端，则需要把末端补平。
3. 使用小牛肠碱性磷酸酶去除载体中的5' 磷酸。
4. 使用T4 DNA 连接酶将阅读框盒连接入载体中。
5. 用连接反应物转化One Shot® ccdB Survival™ 感受态E. coli，并筛选转化子。
6. 分析转化子。
Gateway技术──基因克隆和表达的新技术作者：文/ Invitrogen 公司时间：2004-06-08 11:15:00 来源: 浏览次数 1789次浏览评论Gateway技术具有以下优点：·去除冗长的亚克隆步骤,节省操作时间；·能同时将基因转移到多个表达系统；·在选择的任何系统──体外，细菌，酵母，昆虫，或哺乳动物──进行分析表达。
Gateway技术是一项基因克隆和表达的新技术，通过Gateway技术能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白表达系统（图1）。
这项体外技术大大简化了基因克隆和亚克隆的步骤，克隆效率却高于95%。
当基因在目的表达载体之间快速简便的穿梭时，可以保证正确的方向和阅读框。
此外Gateway技术也有助于进行带不同数目纯化和检测标签蛋白的表达。
Gateway技术利用了位点特异性重组，所以在构建好入门克隆(entry clone)后，不再需要使用限制性内切酶和连接酶。
一旦拥有了一个入门克隆，就可以多次使用，转移目的基因到Gateway兼容的各种表达载体（destination vector）。
由于重组时DNA片段的阅读框和方向保持不变，因而不必再对新的表达克隆进行测序。
这样，在使用每一种新的表达系统时，将会节省更多时间。
目的基因克隆进入门载体后，可以同时转移目的基因到多个目的载体。
Gateway技术是克隆和亚克隆DNA序列的一项新颖的通用系统，便于功能基因的分析和蛋白的表达。