无吸收 无吸收 有吸收 有吸收
外加试剂 吸收情况
参比溶液 选择
无吸收
纯溶剂空白
有吸收
试剂空白
无吸收
试液空白
有吸收 加入掩蔽剂的溶液
狭缝的选择
• 狭缝的大小会影响到仪器的信噪比和标准曲线的 线性范围。
• 狭缝过大，通常会使线性范围变小，特别是当不 在最大吸收波长位置测定时更是如此。
• 狭缝过小，造成入射光能量过小，信噪比变差， 基线平直度和测量数据的重复性会变差。
分光光度计的结构
• 分光光度计 I0 溶
分光光度计光路
双光束分光光度计
• 分光光度计
I0 溶 I 液
双光束分光光度计
光源
单色器
样品池
检测器
显示装置
样品池
消除了光源不稳定性造成的误差，测试结果准确 需要对光路的不对称性进行校正，这个操作通常称为校零或基线校正
• 内壁材料：BaSO4，聚 四氟乙烯
• 适宜于测量粉末样品 • 样品可压片或与BaSO4
混合后压片制样
吸收池及使用常识
• 分光光度法中的吸收池又称比色 皿，可见分光光度法中使用的比 色皿用光学玻璃制造，可用于大 于350nm的波长范围。
• 常用的比色皿有0.5－10cm各种 光程，可根据需要选用
不同相态样品的分析
• 通常的紫外可见分光光度计只能进行溶液 样品的分析。
• 配以合适的样品架，可以测量气体，也可 以对透明的薄片（如滤光片）或薄膜状材 料进行定性分析。
• 固体粉末样品由于通常透光性质不好，需 要配成溶液或用积分球附近进行漫反射谱 测量。
积分球与固体漫反射谱
• 获得固体漫反射谱，可 以间接反映固体样品的 吸收
参比溶液与吸光度的测定
• 遮挡光路，调透过率（透过 光强度）为0
挡
光 It=0
板
• 开启光路，放入参比溶液，
调透过率为100％，即A参比 =0
参 比
I0
溶
液
• 取出参比溶液，放入样品溶 液，读数得到样品中待测组 分的吸光度
待 测
It
溶
液
待测溶液的制备
Fe2+ + 3phen = [Fe(phen)3]
c 0.434T c TlgT
吸光度读数范围
• 根据朗伯比尔定律，A＝bc, 影响吸光度大 小的因素主要是样品摩尔吸光系数，浓度 和比色皿光程。
• 实验中吸光度过大的样品可通过稀释样品 使吸光度到所需范围内。
• 如果样品不能稀释，可以改用光程较小的 比色皿减小吸光度。
• 吸光度过小的样品可使用光程较大的比色 皿以增大吸光度。
吸收波长的选择
• 进行单波长测量时，需要考虑朗伯比尔定 律对入射光单色性的要求和测定灵敏度的 要求。
• 没有干扰时，一般选择在吸收峰的最大吸 收波长位置处，如果有干扰，选择在没有 干扰且吸光度变化较平缓的位置。
• 进行多波长校正时，除尽量满足单波长测 定的波长要求外，还要求多个组分间的吸 收光谱间线性无关。
• 此外，还需要考虑样品吸收峰宽度的影响。通常 单波长测定时，一般选择在最大吸收波长位置， 线性范围容易满足，可选择较宽的狭缝（1-2nm） 多波长测定时，很难同时在所有波长都满足线性 范围要求，应选择较小的狭缝。
4
ABS ABS
0
400
450
500
W a ve le n g th (n m )
狭缝变化对光谱的影响
• 过量的phen
可能对吸光
•
其它加入的试剂(可能包括缓冲试剂， 离子强度调节剂等)
度测定产生 干扰
如何选择参比溶液
• 总的原则：使试液的吸光度能准确反映待测组分的吸收 （在测定波长处有吸收的部分在参比溶液中应保留）
• 理想的参比溶液是：试液中去除待测组分，保留其他所有 组分的溶液
原始待测溶液 吸收情况
2
400
420
440
460
480
500
W a v e le n g th (n m )
吸光度过大造成光谱噪音大
标准曲线法和标准加入法
• 无法或不易得到与样品相近的基体时用标 准加入法
• 同类样品数量较多时用标准曲线法 • 只有一两个样品时可以用标准对照法
重复测定次数和波长扫描速度
• 对吸光度不是很大的样品，或者狭缝不是 很小，这时检测器检测的光信号的强度是 比较大的，重复性较好，可选择较少的重 复次数。相反，如果样品吸光度很大，狭 缝很小，选择较大的重复次数可获得更好 的结果。
参比溶液的选择
• 使用参比溶液是为了校正除待测组分外所 有其他因素所引起的透射光强度的减弱。 所以最佳的参比样品是待测样品中只除去 待测组分后的剩余部分。
• 常用的参比溶液有纯溶剂，空白溶液（不 加试样溶液，含显色剂等），加了掩蔽剂 的试样溶液
混合溶液中待测组分吸光度的测量
I0
待 测 溶 液
It
A总
lg
I0 It
• Abc适用于混合溶液中任一单一组分
• 吸光度的加和性，混合溶液 A总=A待测+A共存 • 也就是 A待测= A总 - A共存 • 若 A参比 = A共存 =0，则 A待测= A总
• 参比溶液，又称空白溶液：分光光度测量中假定 吸光度为0的溶液,应该可以反映除待测组分外所
有其他共存组分的吸收
• 拿持比色皿时不能接触抛光面 • 定量分析时比色面必须配对使用
吸光度读数范围
• 吸光度测量误差在透过率过大 或过小时都会变大，为了满足 定量分析的误差要求(通常为 <5%),在定量分析时要求吸光度 应在一定的范围内
• 吸光度读数范围的具体值与仪 器性能有关，主要是与仪器检
测系统噪声大小及光学系统杂 散光的大小有关，通常都在0.11.0范围内，低档次的仪器通常 可用范围比高档次仪器要小。
紫外可见分光光度计 的使用
紫外可见分光光度计的使用
• 分光光度计的结构类型:单光束分光光度计和双光束分光 光度计
• 不同相态样品的分析 • 比色皿的使用常识 • 吸光度读数范围 • 吸收波长的选择 • 参比溶液的选择 • 狭缝大小的选择 • 重复测定次数和波长扫描速度 • 测定波长间隔 • 标准曲线法和标准加入法 • 时间扫描功能
• 原始待测溶液(含有Fe2+及其它共存组分)
• 加入过量显色剂，根据需要加入其它试剂 (可能包括缓冲试剂，离子强度调节剂等)， 这部分总称为试剂
• 加入溶剂稀释到适宜体积
待测溶液的成分
Fe2+ + 3phen = [Fe(phen)3]
• 待测离子Fe2+
[Fe(phen)3]
• 其它共存组分
如有吸收，