手柄
凹槽 21
PP2000T冷冻样品制备室
各种样品台
样品支架安装在转移装置上 （旁边是插入液氮装置，背 景是控制器）
样品插入冷冻剂
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S E M 制 样 技 术
样品 取样 不含水或 含水少 样品种类 含水 多 清洗 导电 不导电 固定 脱水干燥
镀金 SEM观察并照相
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SEM的制样准则 • 尽可能保持样品本来的形貌和结构 • 在样品的干燥过程尽可能减少样品变形 • 样品表面应有良好导电性能和二次电子 发射率
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微 胶 囊 化 产 品 的 超 微 结 构
表面结构的观察：
在SEM样品台上贴上双面胶，将少许微胶囊化产品的粉末撒于双面胶 上，吹去多余的粉末，然后喷金，采用SEM进行观察。加速电压为 15kV。
内部结构的观察：
撒少许微胶囊化DHA和EPA产品在贴了双面胶的样品台上，稍稍压 实，使一部分粉末陷入双面胶的胶基中。用刀片刮去表面的粉末，然后轻 刮双面胶的表面，立即喷金，然后用SEM进行观察，加速电压为15kV。
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• 临界点干燥（Critical-point drying, CPD）
31.3℃ 72.8 atm
在31.3℃以下， CO2以液态形式存在，在临界温度31.3℃以 上，CO2以气态形式存在，在任何压力下都不能使CO2液化。 在临界温度下，使CO2气体液化所需的最小压力Pc为临界压 力。
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低温（5～10℃）时，将样 品加到液体CO2中，液体CO2 取代有机溶剂，当温度升高到 31.3℃，液体CO2转化成CO2 气体，从加压池中把CO2气体 放出，由于在临界态气液不 分，当液体CO2转化成CO2气 体时，样品干燥未经过两相界 SPI # 13200-AB临界点干燥机 面。
nitrogen slush
the sample and its holder 手柄 in boiling nitrogen
凹槽
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Preparation of samples for cryo-SEM
2）冷冻切割 （在高真空的箱中手工操作 ） 在高真空下，用充分冷却（-100℃）的刀片快速切 削样品，切削时样品形成一个切削的断面，且从断面 上露出表面结构，冰从切面升华（-100℃与高真空 下），于是埋在冰中的结构就暴露出来。 3）镀金
壁结构 表面结构 内部结构 内部结构 （放大倍数500） （放大倍数1000） （放大倍数 2000） （放大倍数4000）
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生 物 样 品 制 备
固定
脱水干燥
装样
镀膜
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固 定
• 固定剂 - 甲醛 (formaldehyde) - 戊二醛 (glutaraldehyde) - 四氧化锇 (Osmium tetraoxide, OsO4) • 固定温度 0～37℃ • 固定时间 10 min～几个小时
溅射/碳镀膜机
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常规扫描电镜样品制备的缺点
• 皱缩和变形 • 可溶性物质被提取 • 可弥散性物质的移位 • 机械损伤 • 制备过程慢 • 有毒试剂
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2. Cold-stage SEM (CryoSEM)
cryo scanning electron microscope (cryo-SEM; cryo =cold) • 在SEM内部装有冷台（cold-stage） • 使样品能保持在低温（-70℃）
• 冷冻干燥
- 样品快速冷冻，水结冰升华，留下空洞， - 一旦形成冰晶，体积膨胀，挤压其它结构，使细胞受损 人工损伤 - 较好的冷冻剂：liquid N2 slush 液氮倒入绝缘杯中，在94Torr真空度下暴露1min。液 氮蒸发，温度下降至-210℃（N2的冰点）。此时固定速 度很快，可避免人工损伤。
OsO4
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脱 水
50%乙醇或丙酮 70%乙醇或丙酮 95%乙醇或丙酮 100%乙醇或丙酮 10～15 min 10～15 min 10～15 min 30 min
用表面张力小的乙醇取代表面张力很大的水 使干燥过程对样品表面产生的影响较少
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干 燥
• 空气干燥
- 自然条件下风干 - 液/气界面巨大的表面张力 非常容易形成人工损伤
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玫瑰花瓣表面的SEM照片 (850X)，CPD干燥
玫瑰花瓣表面的SEM照片 (850X)，风干凝固
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装样
Charging artifacts
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镀膜 • 真空镀膜法
金属在真空下由于高温而 蒸发，产生的金属粒子从一个 方向以一定的角度喷涂于样品 的表面，在样品的表面上沉积 了一层厚薄不同的金属粒子。
扫描电镜和透射电镜样品制备技术
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1. SEM
• 可以观察大尺度的样品，从毫米到厘米尺寸的样 品都可以观察，弥补了LM和TEM之间的断层 • 成块样品不用制成超薄切片，样品制备方法要简 单得多 • 图像是三维立体图像，富有立体感 • 特别适合于细胞表面和组织表面特征信息的研究 • SEM操作比TEM容易
KPP2000 Cryo-SEM fitted on a JEOL 6490 SEM
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Preparation of samples for cryo-SEM
1）快速冷冻样品（在N2 Slush中） Slush制备：在绝缘杯中把液N2暴露于真空度94Torr 下1 min，液N2剧烈地蒸发，使自身的温度降低到N2的 冰点（-210℃） ，再将样品放入。
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冰冻扫描电镜系统的优点
• • • • • • • • • 能保持可溶性物质 机械损伤小 基本上不用有毒试剂 是对样品进行动态实验的唯一方法 过程快 通过低温断裂获取额外信息 很适合液体、半液体、和电子束敏感样品 具有选择性刻蚀能力（通过升华显露内在信息） 具有重复使用样品能力
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KPP2000冷冻样品制备室
金属发射源
蒸发法真空镀膜装置
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• 溅射镀膜法
溅射 ----- 在低真空中进行弧光放电时，由于离子冲击， 阴极金属物质有飞溅现象 当真空罩内的真空度抽到10～1 Pa时，在阴极与阳极之间加上 1000～3000 V的直流电压，两极之 间产生弧光放电的电场。 在电场的作用下，罩内残余的气 体分子被电离为正离子和电子，正 离子被阴极吸引轰击金属靶，激发 出金属颗粒和电子，并被阳极吸引 附着在样品表面而形成金属导电 膜。