实验十 微生物菌种保藏方法
[日期：2009-
5-30]来源： 作者：孔庆学
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实验十微生物菌种保藏方法
菌种是一种重要的生物资源，菌种保藏是重要的微生物基础工作。

菌种保藏就是利用一切条件使菌种不死、不衰、不变，以便于研究与应用。

(一)常规保藏方法
1 目的
1.1 了解菌种保藏的基本原理
1.2 掌握几种常用的菌种保藏方法。

2 原理
菌种保藏的方法很多。

其原理却大同小异，不外乎为优良菌株创造一个适合长期休眠的环境,即干燥、低温、缺乏氧气和养料等。

使微生物的代谢活动处于最低的状态，但又不至于死亡，从而达到保藏的目的。

依据不同的菌种或不同的需求，应该选用不同的保藏方法。

一般情况下，斜面保藏、半固体穿刺,石蜡油封存和砂土管保藏法较为常用，也比较容易制作。

3 材料
3.1菌株
待保藏的适龄菌株斜面
3.2培养基
肉汤蛋白胨斜面，半固体及液体培养基。

3.3 试剂
10%HCl无水氯化钙、石蜡油、五氧化二磷。

3.4 器具
用于菌种保藏的小试管(10*100毫米)数支、5毫升无菌吸管、l毫升无菌吸管等、灭菌锅、真空泵、干燥器、冰箱无菌水、筛子(40目、120目)、标签、接种针、接种环、棉花、牛角匙等等。

4 流程
斜面保藏→半固体穿刺保藏→石蜡油封存→砂土管保藏
5 步骤
5.1斜面保藏
5.1.1流程
标记试管→接种→培养→保藏
5.1.2步骤
5.1.2.1贴标签
取无菌的肉汤蛋白胨斜面数支。

在斜面的正上方距离试管口2-3厘米处贴上标签。

在标签纸上写明接种的细菌菌名、培养基名称和接种日期。

5.1.2.2斜面接种
将待保藏的细菌用接种环以无菌操作在斜面上作划线接种。

5.1.2.3培养
置37恒温箱中培养48小时。

5.1.2.4保藏
斜面长好后，直接放入4℃的冰箱中保藏。

这种方法一船可保藏三个月至半年。

5.2半固体穿刺保藏
5.2.1流程
标记试管→穿刺接种→培养→保藏
5.2.2 步骤
5.2.2.1贴标签
取无菌的半固体肉汤蛋白等直立柱数支，贴上标签，注明细菌菌名、培养基名称和接种日期。

5.2.2.2穿刺接种
用接种针以无菌方式从待保藏的细菌斜面上挑取菌种，朝直立柱中央直刺至试管底部，然后又沿原线拉出。

5.2.2.3培养
置37恒温箱中培养48小时。

5.2.4保藏
半固体直立柱长好以后，放入4℃的冰箱中保藏。

这种方法一般可保藏半年至一年。

5.3石蜡油封存
5.3.1流程
标记试管→接种→培养→加石蜡油→保藏
5.3.2 步骤
5.3.1标记
同5.1.2.1
5.3.2接种
同5.1.2.2
5.3.3培养
同5.1.2.3
5.3.4加石蜡油
无菌操作下将5毫升石蜡油到培养好的菌种上面，加入的量以超过斜面或直立柱1厘米高为宜。

5.3.5保藏：石蜡油封存以后，同样放入4℃冰箱中保存。

也可直接放在低温干燥处保藏。

这种方法保藏期一般为一至二年。

5.4砂土管保藏
5.4.1 流程
制沙土管→灭菌→制菌液→加样→干燥→保藏
5.4.2 步骤
5.4.2.1制作沙土管
选取过40目筛的黄砂，酸洗，再水洗至中性，烘干备用；过120目筛子的黄土备用；按1份土加4份砂的比例均匀混合后，装入小试管，装量1厘米左右。

5.4.2.2灭菌
加压蒸汽灭菌，直至检测无菌为止。

5.4.2.3制备菌液
取3毫升无菌水至待保藏的菌种斜面中，用接种环轻轻刮下菌苔。

震荡制成菌悬液。

5.4.2.4加样
用1毫升吸管吸取上述悬液0.1毫升至砂土管，再用接种环拌匀。

5.4.2.5干燥
把装好菌液的砂土管放入干燥器或同时用真空泵连续抽气，使之干燥。

5.4.2.6保藏
干燥后的砂土管可直接放入冰箱中保藏；也可以用石蜡封住棉花塞后放冰箱中保藏。

（二）冷冻干燥保藏法
1目的
1.1理解冷冻干燥保藏菌种的原理
1.2掌握冷冻干燥保藏菌种的方法。

2　原理
冷冻干燥保藏菌种法可克服简单保藏方法的不足。

利用有利于菌种保藏的—切因素，使微生物始终处于低温、干燥、缺氧的条件下，因而它是迄今为止最有效的菌种保藏法之一。

3　材料
3.1　菌株
待保藏的各种菌种。

3.2试剂
2% HCl；牛奶。

3.3器具
安瓿管、标签、长滴管、脱脂棉、干冰、离心机、冷冻真空装置、高频电火花器。

4 流程
备安瓿管→备脱脂乳→制菌悬液→分装→预冻→真空干燥→保藏→活化5步骤
5.1准备安瓿管
安瓿管先用2%HCl浸泡，再水洗多次，烘干。

将标签放入安培管内，管口塞上棉花，灭菌备用。

5.2制备脱脂乳
用鲜奶经处理或使用脱脂奶粉配兑脱脂牛奶，灭菌，并做无菌试验后备用。

5.3制菌悬液
将无菌牛奶直接加到待保藏的菌种斜面内，用接种环将菌种刮下，轻轻搅乱使其均匀地悬浮在牛奶内成悬浮液。

5.4分装
用无菌长滴管将悬浮液分装入安瓿管底部，每支安培管的装量约为0.9毫升。

(一般装入量为安瓿管球部体积的1／3)
5.5预冻
将分装好的安瓿管在-25至-40之间的干冰酒精中进行预冻1小时；或在冰箱冷冻室进行预东。

5.6真空干燥
预冻以后，将安瓿管放入真空器中，开动真空泵进行干燥。

5.7封管
封管前将安瓿管装入歧管；真空度抽至0.01毫米汞拄后，再用火焰熔封，封好后，要用高频火花器检查各安瓿管的真空情况。

如果管内呈现灰蓝色光，证明保持着真空。

检查时高频电火花器应射向安瓿管的上半部。

5.8保藏
做好的安瓿管应放置在低温避光处保藏。

5.9活化
如果要从中取出菌种恢复培养，可先用75%酒精将管的外壁消毒，然后将安瓿管上部在火焰上烧热，再滴几滴无菌水，使管子破裂。

在用接种针直接挑取松散的干燥样品，在斜面接种。

6结果
6.1简述真空冷冻干燥保藏菌种的原理。

6.2 记录大肠杆菌斜面作液体石蜡封藏和枯草杆菌作沙土管保藏的要点。

7思考
7.1菌种保藏中，石蜡油的作用是什么？
7.2经常使用的细菌菌株，使用那种保藏方法比较好？
7.3沙土管法适合保藏那一类微生物？。