0 样品稀释液/ml 蒸馏水/ml 双缩脲试剂/ml 1.0 4.0 1 0.5 0.5 4.0
Байду номын сангаас
A540
3、计算
取两组测定的平均值计算：
YN 固体样品蛋白质的含量 (%) 100 % c
Y为标准曲线查得蛋白质得浓度（mg/ml） N为稀释倍数 c为样品原浓度（mg/ml）。
较低 较小
其他方法
染色法
紫外 吸收法
水杨酸比色法
采用凯氏定氮法测一样品的粗蛋白含量，根据下 列记录的数据计算：
水份含量=8.0%，1 号样品重量=1.015g，2号样
品重量=1.025g，用于滴定的标准HCl浓度
=0.1142mol/L，1号样品所用的HCl溶液的毫升数
=22.0mL，2号样品的HCl溶液的毫升数=22.5mL， 空白的HCl溶液的毫升数=0.2mL，分别以样品的干 基和湿基计算粗蛋白质含量，假定该蛋白质含有 17.5%的氮。
2、基本结构单位：氨基酸 3、蛋白质的变性作用。
4、蛋白质分析的重要性
生物活性测定
功能性质调查
营养标签
总蛋白质含量
氨基酸组成
蛋白质的营养价值
5、蛋白质的测定方法
凯氏定氮法
利用蛋白质共性的方法
杜马斯法
福林酚法
利用特定氨基酸残基法
染色法
第二节 蛋白质的定性测定
一、蛋白质的一般显色反应
电泳或纸层析之后用一些染料与蛋白质结合并
加速有机物氧化速度
②
蒸馏
NH4+ + OH== NH3 +H2O
影响氨化完全和速度的因素
（1）K氏烧瓶和取样量
（2）分解剂
1g样品
K2SO4： H2SO4 =
7g : 12ml
还有一种比例： K2SO4：
H2SO4 = 10g : 20ml
③ 吸收与滴定
<1>用4%硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定
第四节
氨基酸定量测定
一、甲醛滴定法
氨基酸本身有碱性-NH2基，又有酸性COOH基，成中性内盐，加入甲醛溶液后， 与-NH2结合，碱性消失，再用强碱来滴定 -COOH基。
反应式（有几种不同的推论）如下：
双指示剂：百里酚酞+中性红指示剂
同时取两份样
① +中性红，用NaOH滴定 ② +百里酚酞+中性甲醛+NaOH滴定
变色。书中列举了 5 种染料。
二、复合蛋白质的显色反应 （一）糖蛋白的显色（3种方法） （二）脂蛋白的显色（2种方法）
第三节 蛋白质的定量测定
关于氮-蛋白质换算等数 6.25
= =
6.38
6.25 5.95
=
一、凯氏定氮法
常量凯氏定氮法
1. 原理
样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋
白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水
1、选择冰乙酸作为溶剂 2、选择高氯酸进行滴定
三、电位滴定法
根据氨基的两性作用，加入甲醛以固定氨基 的碱性，使羧基显示酸性，将酸度计的玻璃电
极和甘汞电极同时插入被测液中构成电池，用
NaOH 标准溶液滴定，根据酸度计指示的pH
值判断和控制滴定的终点。
pH
8.2
9.2
氨基酸自动分析仪法
在测定某厂酱油氨基酸态氮含量时，酱油5mg于100mL
凯氏定氮仪
凯氏定氮仪
二、双缩脲法
NH2—CO—NH2 + NH2—CO—NH2 △150~160℃ NH2—CO—NH—CO—NH2 + NH3 双缩脲
双缩脲能和硫酸铜的碱性 溶液生成紫色络和物。 紫色络合物。
操作方法
1、制作标准曲线 取10支干试管分成两组，按下表平行操作：
0 标准蛋白液/ml 1 0.2 2 0.4 3 0.6 4 0.8 5 1.0
福林-酚法（双缩脲法的发展）
两步反应
(1)在碱性条件下，蛋白质与铜离子作用生成蛋
白质—铜络合物。
(2)此络合物将试剂磷钼酸—磷钨酸(Ｆolin试剂) 还原，混合物深蓝色(磷钼蓝和磷钨蓝混合物) 。
杜马斯法（燃烧法）
样品在高温下（700-800℃）燃烧，释放的
氮气由带热导检测器（TCD)的气相色谱仪测定。
逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合
成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。
整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定 ① 消化
2NH2(CH2) 2COOH+13H2SO4 (NH4) 2SO4+6CO2+12SO2+16H2O <1>加硫酸钾 作为增温剂，提高溶液沸点
<2>加硫酸铜
<3>加氧化剂
作为催化剂、消化终点指示剂
4.NaOH 溶液
4.5.6 5.水洗漏 步操 斗数次 作要 6.夹好漏斗 迅速 夹，水封。
2.管下端 插入液面 下(瓶内先 装硼酸液 及混合指 示剂2滴)
8.吸收液用0.01000mol/L 7.水蒸气蒸馏至指示剂变绿色 HCl标准溶液滴定至 开始计时，蒸馏10min，将管 尖端提离液面再蒸馏1min ，用 微红色为终点 水冲洗管尖后停止蒸馏 同时做空白
指示剂：混合指示剂（甲基红—溴甲基酚绿） 指示剂 红色 绿色 红色
（酸）
（碱）
（酸）
反应式为： NH3+H3BO3==NH4++H2BO3-
H2BO3-+H+==H3BO3
<2> 用过量的 H2SO4 或 HCl 标准溶液吸收，再
用 NaOH 标准溶液滴定过剩的酸液。
现测定某一种食品的蛋白质的含量，
容量瓶中，加水定容，混匀后吸取此液20mL进行测定，用 0.05N氢氧化钠滴定至pH值为8.2时，消耗标准碱液7.0mL, 加入10.0mL甲醛溶液，混匀。用标准溶液继续滴定至pH9.2 时，消耗标准碱液10.12mL,同法作空白实验，滴定至pH值
为8.2时，消耗标准碱液0.08mL, 加入甲醛后滴定至pH9.2
二、非水溶液滴定法
在水溶液中 1、能溶解的物质有限，尤其是有机物质 2、水的两性太强，能在水中滴定酸、碱范围较窄 3、本身会与水起反应而生成酸的某些物质不能滴 定。
溶剂选择原则
1、不引起副反应
2、溶剂应能溶解试样及滴定反应产物
3、应考虑溶剂的酸碱性
对于酸的滴定，溶剂的酸性应越弱越好
氨基酸的非水溶液滴定
计 算
X =
C(
V V M
1

2
)
K 100 % N
W 1000
X为样品中蛋白质的含量 V1为样品消耗盐酸标准液的体积
V2为试剂空白消耗盐酸标准液的体积
C为盐酸标准液的浓度
MN为氮的摩尔质量
W为样品的质量 K为氮换算为蛋白质的系数
3.消化液 微量凯氏定氮法 10mL 1.装水至 2/3 容积 处，加甲 基橙数滴 及硫酸数 毫升以保 持酸性
这种样品含有大量的脂肪，样品经过处理 大量的脂肪
后加入浓硫酸，为了使浓硫酸与样品充分
结合，经振摇后大火加热进行消化；消化 消化 振摇 大火加热
2h 后，估计消化完全，取出消化液加入少 少 2h 后，估计消化完全
量 量NaOH NaOH 进行蒸馏，硼酸（加入了指示剂甲 基红-溴甲基酚绿）作为吸收液，最后对 吸收液进行滴定。
测得的含氮量转换成样品中的蛋白质含量。
几种蛋白质测定方法比较
凯式定氮法 原理 装置 溶剂 时间 灵敏 度 干扰
总氮量
双缩脲
蛋白氮
杜马斯
总氮量
福林-酚
蛋白氮
凯式定氮装置 分光光度计
浓硫酸 长
高温装置、GC 分光光度计
不需要 3min 高 较小 福林-酚试剂 简单快速 高 酸类及柠檬 酸类
用量较少 简单快速 低 有干扰
时，消耗标准碱液0.90ml。问该样品的氨基酸态氮含量？
0.301% 你 算 对 了 吗？
第九章 蛋白质及氨基酸的测定
Determination of protein and amino acid in Food
第一节
protein）

概述
1.蛋白质的元素组成（The elements of
C：50-55% N：15-18%
O：20-23%


H：6-8%
S：0-4%
微量元素：P、Fe、Zn、Cu
蛋白浓度 /(mg/ml) 蒸馏水/ml 双缩脲试剂/ml
A540
2.0
1.0 4.0 0.8 4.0
4.0
0.6 4.0
6.0
0.4 4.0
8.0
0.2 4.0
10.0
0.0 4.0
取两组测定的A540值的平均值，即A540为纵坐标，蛋 白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。
2、样品测定 取4支试管分成两组，按下表平行操作：