特点： λem（荧光）>λex（激发光） 寿命短 10-9—10-7s
二、激发光谱与荧光光谱
1、荧光的检测
单色器
I0
I
λex
λem 单色器
表面吸 光物质
检测器
2. 荧光光谱（发射光谱）： 激发波长λex和强度一定时，测定荧光强度（F） 与荧光波长之间的关系。
单色器
I0
λex
I 表面吸
光物质
F
λem 单色器
其中以速度最快，激发态寿命最短的途径占 优势。
S2*
S1*
S0 (a)
a 吸收 b 振动弛豫
（b）
V4 V0VV1V2 3
c 内部能量转换 d 荧光 e 体系间跨越
(c)
f 磷光
（b）
V4
(e)
VV3V1 2 V0
V4VV2 3 V1
T1*
V0
V4 VVV123
(d)
(f)
V0
（7）荧光的产生
① 吸收光 基态—激发态 ② 振动弛豫，使电子回到第一电子激发 态最低振动能级 ③ 回到基态不同的振动能级 ④ 振动弛 豫
振动能级：物质分子中存在一系列电子能级， 而每个电子能级中又包含一系列的振动和转 动能级。
电子能级
振动能级 转动能级
2、荧光的产生
（1）振动弛豫：同一电子能级电子从高的 振动能级到最低的振动能级。
电子能级 原因：分子碰撞 结果：热能，无辐射
振动能级
（2）内部能量的转移
产生原因：受激分子常由高电子能级以无辐射 （热）跃迁方式转移至低电子能级。
电子能级
振动能级
（3）荧光发射 无论分子处于哪一个激发单线态，通过内转换 及振动弛豫，均可返回到第一激发单线态最低 能级，然后以辐射的形式发射光量子而返回到 基态的任一能级。
第二激发态
第一激发态
电子能级
振动能级
特点：荧光的能量小于激发光能量。 荧光发射所需时间为10-9~10-7s。
（4）外部能量的转移 激发态分子与溶剂分子及其它溶质分子之间相 互碰撞而失去能量，常以热能的形式放出。
四、影响荧光的外界因素
1、溶剂 A 溶剂的极性：极性越大， λem增大，荧光效率 也增强。通常选择极性溶剂。 B 粘度：粘度系数越大，有利于荧光效率的提 高。
2、温度 温度越高，碰撞机率大，效率减少。热淬灭
3、 pH值：酸度改变了弱酸弱碱的结构，从而 使其荧光效率受到影响。
OH NH+3
-
H+
NH2 OH-
例
激发光 205nm 荧光 278nm 荧光效率 0.11
286nm 321nm 0.29
356nm 404nm 0.36
B 分子的刚性和共平面性
荧光效率：0.2
1.0
C 取代基：给电子基团使荧光效率增大，如 -OH、-OCH3、-NH2等。
吸电子基团使荧光效率减少，如-COOH、NO2、-X。
中性基团对荧光效率影响不大。如-R、 NH3+等。
熄灭。
（6）磷光：经过体系间跨越的分子降至三线 态最低能级，跃迁至基态而发生的光。
过程： 吸光—单线态—弛豫—跨越—弛豫—基态—磷光
电子能级
振动能级
特点：（1）λ（磷光）>λ（荧光） （2）寿命10-4—10s （3）室温下溶液很少呈现磷光
处于激发态的分子回基态的途径： ①发射荧光 ②发射磷光 ③内部能量转换 ④ 外部能量转换
自熄灭现象：当荧光物质的浓度升高而产生。
荧光熄灭法：利用荧光强度的减小与荧光熄灭 剂的浓度呈线性关系来进行测定含量的方法。
F
C
5、散射光的影响 引起光的散射原因有：比色皿表面，溶液 内微粒，溶液内气泡。
第4章 荧光分析法
§1 概述
hν+ 吸收 发射
1、光致发光：
热、光
激发态电子回到低能级而伴随光的辐射
分类：
磷光
紫外线荧光
分子荧光 X-射线荧光
荧光
原子荧光
红外光荧光
激发光 源为紫 外光
2、荧光分光光度法：利用物质的荧光光谱 进行行定性定量分析方法 。
F（强度）、λ 荧光分光光度计：用来测量荧光强度的仪器。 3、特点：灵敏度更高 10-10-10-12g/ml，应用 不如UV广泛。
F
λem 单色器
检测器 λ
特征： （1）位移：λem>λex stokes 位移：说明在激发和发射之间存在一 定的能量损失。 产生原因：振动驰豫、内转换
第二激发态
第一激发态
电子能级
振动能级
（2）荧光光谱的形状与激发波长无关 （3）荧光光谱与激发光谱相似 （4）荧光强度与激发光波长有关
三、荧光与分子结构的关系 荧光物质发生荧光的过程：
检测器 λ
问题（1）不同强度的光照射物质所产生 的荧光光谱形状是否相同？
（2）不同波长的光照射物质所产生的荧 光光谱是否相同？ 是否影响荧光强度?
单色器
I0
I
λex
λem 单色器
表面吸 光物质
检测器
3、激发光谱：荧光λex不变时，记录荧光 强度F与激发波长之间的关系。
单色器
I0
λex
I 表面吸
光物质
Q* M Q M *
这种不同物质间的能量转移现象，叫荧光 淬灭（熄灭）。M叫荧光淬灭剂。 外部能量转换可降低荧光强度。
（5）体系间的跨越 激发态分子的电子发生自旋反转，而使其
多重性发生变化。激发单线态—激发三线态 发生条件：常需物质中含有重原子如Br、I等
电子能级 振动能级
分子由激发单线态跨越到三线态后，荧光强度减弱甚至
4、应用：①直接荧光光度法 ②作为HPLC的检测器（用的多）
③TLC定性、定量
§2 原理 一、分子荧光产生
1、分子的电子能级： C C C C
ψ4
π*
π* ψ3
π
ψ2
π
ψ1
三线态与单线态比较：
UV
基态单线态 ① 单线态 ②三线态 激发态
E2<E1 ，ε2<ε1， ② 的寿命可达1秒，而①的 寿命为10-8，跃迁几率①是②的106倍。
A 荧光物质对光的吸收 B通过无辐射跃迁，跃迁到第一电子激发态 的最低振动能级。
C 跃迁至基态各振动能级 D 各振动能级分子，通过无辐射跃迁回基 态的最低振动能级。
1、荧光物质的必要条件 A 强吸光结构，共轭π—π* B 高荧光效率。
发射荧光的光子数。 荧光效率（φf）= 吸收激发光的光子数
2、分子结构与荧光的关系 A 长的共轭结构
_ 7 ~ 12
pH 13
4、荧光熄灭剂：引起荧光熄灭的物质为荧 光熄灭剂。
荧光熄灭：是指荧光物质分子与溶剂分子或溶 质分子相互作用，引起荧光强度降低的现象。
引起荧光熄灭的形式：
碰撞熄灭：由于碰撞而损失能量 化学淬灭：荧光物与加入的物质发生反应， 生成新的化合物。 体系间跨越：单线态变成三线态。