基因治疗的发展现状与展望发表时间：2012-07-03T14:30:12.420Z 来源：《医药前沿》2012年第3期供稿作者：林清凡1 傅增顺2 [导读] 基因治疗是一种新的治疗手段，可以治疗癌症、遗传性疾病、自身免疫性疾病等多种疾病。
林清凡1 傅增顺2 （1福建师范大学生命科学学院 350108； 2厦门市第二医院福建厦门 361021）【摘要】基因治疗是一种新的治疗手段，可以治疗癌症、遗传性疾病、自身免疫性疾病等多种疾病。
基因治疗的主要目标是发展安全和高效的基因导入系统，它们能将外源遗传物质靶向性地导入到特异的细胞，并使其整合入基因中。
通过这种修复受损基因的方式来达到治疗目的。
本文主要综述病毒性载体系统和以siRNAs为基础的基因治疗，来展示基因治疗现状以及发展前景。
【关键词】基因治疗病毒载体系统 RNA干扰临床试验【中图分类号】R459.9 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2012）03-0133-02 基因治疗是指用具有正常功能的基因置换或增补患者体内有缺陷的基因，因而达到治疗疾病的目的。
或把某些遗传物质转移到患者体内，使其在体内表达，最终达到治疗某种疾病的方法[1]。
最初的提出是针对单基因缺陷的遗传疾病，目的在于用一个正常的基因来代替缺陷基因或者来补救缺陷基因的致病因素。
其核心是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物医学新技术。
目前开展的基因治疗只限于体细胞，主要治疗遗传病、恶性肿瘤、心血管疾病、感染性疾病等严重威胁健康疾病。
将外源的基因导入生物细胞内必须借助一定的载体，腺病毒载体是目前基因治疗最为常用的病毒载体之一。
而RNA干扰技术作为一种高效的控制基因表达方式，也是基因治疗中的常见手段。
1 基因治疗的病毒载体 1.1 腺病毒载体腺病毒（DNA病毒）是较早用来转基因的一种载体，对人体无致病性，生物安全性好，宿主范围广，是IL一2肿瘤基因治疗中的较为合适的载体。
但腺病毒在进入宿主细胞后，其病毒DNA并不整合到宿主基因组上，且腺病毒通过衣壳纤维蛋白与细胞表面CAR（腺病毒受体）结合进入细胞，而只10%-15%的细胞表面有CAR表达，缺乏受体，这导致其转导效率低。
通过提高腺病毒的滴度可提高转基因效率[2]，但是病毒滴度过高又会破坏细胞，使转导效率降低。
Karen等 [3]通过在腺病毒与细胞的混合培养物中加入多种细胞因子以保护细胞集落，提高了转导效率。
Shayakhmetov等 [4]以腺病毒为基础制成一种嵌合体载体，在衣壳上表达短轴纤维蛋白可以结合到细胞表面的另一种表达较多的受体上，从而提高了转导率。
载体改造可提高转导率，从而为腺病毒载体转基因的应用开辟新前景。
1.2 逆转录病毒载体世界上应用基因治疗的首例临床病例所应用的导入载体就是逆转录病毒载体，对它的研究也最为深入。
逆转录病毒载体保留了病毒基因组两端序列，缺失了包装感染性病毒所需的蛋白质编码序列（由外源基因取代）。
其最大的优点是可以有效整合入靶细胞基因组中，并稳定持久地表达所带的外源基因，以转座的方式整合，其基因组不会发生重排，因此所携带的外源基因也不会改变，而且转染率高。
Gondi 等 [5]采用双顺反子逆转录病毒载体介导的基因片段治疗胶质瘤，明显抑制了肿瘤的血管生成。
逆转录病毒载体不足之处，只能转导分裂期的细胞，宿主范围有限，这对于转导细胞是一大障碍。
只能通过细胞因子来刺激细胞进入分裂期，从而促进逆转录病毒转导 [6]。
另外，容量小（携带8Kb外源基因）；与宿主基因组随机整合可能诱发基因突变和激活癌基因；病毒滴度低，低于治疗大肿瘤需要的滴度，故在应用上有一定局限性。
1.3 慢病毒载体慢病毒是经由HIV-1型演变而来的一种RNA病毒，属于逆转录病毒亚类。
染色体基因组中具有核苷酸定位信号序列，能高效地感染靶细胞，稳定表达外源基因。
可感染静止期、分裂细胞，传递较长的基因片段，宿主适应范围较广，能够高效整合、高效表达目的，成为备受关注的一种真核生物基因转染载体。
由于HIV的众所周知的致病性，要将其真正用于基因治疗必须经过改造。
Douglas等 [7]用VSV-G包被人免疫缺陷病毒，并在转入基因上接入启动子等元件进行载体修饰，不仅增加了生物安全性，而且高表达外源基因。
为了提高慢病毒载体的生物安全性，Woods等 [8]把HIV病毒的3’端LTR去除了400个bp的核苷酸，制成一种可以自身灭活的慢病毒载体。
HIV病毒是介导转基因治疗的理想载体。
2 基因治疗的工具 — siRNAs RNAi现象广泛，正迅速发展成为基因治疗的新手段，在很大程度上是因为其作为细胞内源性基因表达调节物质的低毒性和特异性。
siRNAs是由Dicer等核酸内切酶在细胞质中将dsRNA剪切为21-23个核苷酸的siRNA双链，与诱导沉默复合物(RISC)结合后裂解为siRNA单链，与siRNA单链完全互补结合的同源性靶mRNA被RISC剪切降解，从而达到基因沉默的目的。
2.1 siRNAs的基因沉默效率及其安全性 mRNA的二级结构和三级结构能够影响siRNA的沉默效率，并且siRNAs比各种寡脱氧核苷酸更有效，且具有长发夹结构的RNA比锤头结构的核酶能更强烈的抑制靶基因表达，作用时间更长。
有研究表明向大鼠脑内注射表达siRNA能引起长达7周之久的基因沉默效应[9]。
低浓度的siRNAs就能启动基因沉默的过程，所以要考虑到安全性。
由于其高效快速性，减少了与非特异性蛋白结合的可能，这有利于减少siRNAs在治疗中的非特异性反应。
事实上研究认为siRNAs引起的非特异性反应与siRNAs的浓度、细胞类型以及siRNAs的转染方式有关，且证明转染中等浓度的siRNAs并不引起全身非特异性反应（干扰素反应），不影响细胞生长 [10]。
2.2 siRNAs的表达通过载体表达双链短发夹样RNA(short hairpin-like RNA，shRNA)进入到细胞内，后者在细胞内可转化为siRNA而发挥基因沉默效应，而且通过RNAi途径还能修饰细胞染色质达到转录水平的基因沉默，这使具有靶向性的药物应用于基因治疗成为可能。
表达siRNAs的载体通常含有RNA聚合酶III启动子(RNA polymerase III promoter，pol III)，转录生成与miRNA前体相似70nt左右的shRNA，然后在细胞内变成siRNA发挥基因沉默效应。
表达siRNA的病毒性载体都能有效转染细胞中，能够长时间整合到基因组中并“敲除”内源性基因。
研究表明含pol III的表达载体能在体内产生由数百个碱基对构成的shRNA，而不诱导非特异性干扰素反应，这为siRNAs应用于哺乳动物提供了一种安全的新方法[11]。
2.3 siRNAs在活体中的治疗应用表达siRNAs的病毒载体为研究基因功能和治疗疾病提供了新方法，已经有几种病毒被设计用于表达siRNAs。
它们通常以附加体的形式随机、低频整合到宿主基因组中。
siRNAs在肝中靶基因的沉默效率达90%以上，通过沉默肝中内源性凋亡基因的表达，可以广泛应用于治疗各种肝损伤和肝病[12]。
siRNAs通过抑制病毒自身或者抑制病毒转录所必须的辅助因子达到抗病毒的目的，将乙型肝炎病毒(HBV)基因组和siRNAs共转染可以有效降低HBV的复制水平和蛋白合成[13]。
不经载体直接导入的siRNAs须进行化学修饰，因为虽然siRNAs双链能抵抗核酸内切酶的降解作用，但未被修饰的siRNAs不能迅速进入细胞内，还是存在被机体清除的可能。
美国FDA已批准经过修饰的siRNAs进行临床新药试验，用于治疗与年龄相关的黄斑退行性改变(agerelated macular degeneration)的患者 [14]，其基因沉默程度与基因敲除的相近，这实现了siRNA作为静脉注射性治疗药物的可能。
3 基因治疗的现状基因治疗随着DNA重组技术的成熟而发展，被认为是医学和药学领域的一次革命，必将对生物医学和制药业产生深远影响。
研究表明多种疾病与基因的结构或功能改变有关，因而萌生了从基因水平治疗疾病的梦想。
1968年首次提出了基因疗法的概念；1990年美国成功基因治疗了一位因ADA基因缺陷导致严重免疫缺损的4岁女孩，成为首个基因治疗临床试验；2004年，首个治疗产品重组人p53抗癌注射液面世，全球基因治疗走向产业化发展[15]。
全世界范围内基因治疗的临床试验方案已有上千个，但真正有效的、具有良好的发展前景的仅占不到10%，所以必须加强基因治疗中的关键基础问题的研究与对临床试验方案的监管力度，使基因治疗从狂热转入理性化的正常轨道。
在所有的临床试验方案中：恶性肿瘤占全部基因治疗临床试验方案的首位，其次为心血管疾病、单基因疾病等与遗传相关性高的疾病，而对艾滋病(A I D S)的临床试验方案占10%[16]。
目前这些基因治疗临床方案大多数处于I/I I 期临床试验阶段，仅有不到5‰的方案达到了临床II I 期水平，大多数临床试验疗效有限。
在基因治疗临床试验及产业化领域，美国均领先于世界。
我国基因治疗基础研究和临床试验开展较早，基本与世界同步。
对单基因遗传病、恶性肿瘤、心血管疾病、神经性疾病、艾滋病等多种人类重大疾病开展了基因治疗基础和临床试验研究。
在病毒载体研发，心血管基因治疗和肿瘤基因治疗方案取得了一定进展，已有近30项基因治疗方案进入了临床试验阶段。
4 基因治疗的问题和展望基因治疗存在的主要问题是有效性和安全性。
(1)核心问题在于基因治疗的靶向性低。
在基因治疗恶性肿瘤的方案中，只能直接载体注射到肿瘤局部。
若静脉注射，载体将很快被清除，难以达到治疗效果。
(2)基因治疗安全性。
病毒载体免疫原性较强、高滴度时有明显的细胞毒性[17]。
病毒载体其插入或整合到基因组位置是随机的，有引起插入突变及激活癌基因的潜在危险。
(3)理想的基因治疗应能根据病变的性质和严重程度不同，调控治疗基因适当的表达。
但对调控机理的有限认识以及现有载体的有限容量，无法包容完整的调控序列，使达成这一目的很难办到。
（4）基因治疗可能具有潜在的、长期的、延迟的副作用。
有效性和安全性的解决在于基因传递系统，扩大载体容量、构建可控性表达载体、采用非病毒传递系统。
阳离子多聚物载体、纳米颗粒载体、脂质体、聚乙烯亚胺等生物相容性载体将成为一套很有前景的基因传递系统[18]。
非病毒传递系统在遗传病的基因治疗方面应用显示出优势，也被越来越多用于治疗恶性肿瘤、感染性疾病以及组织工程研究。
通过下调致痛(nociception)基因表达和上调抗痛(antinociception)基因表达，基因治疗特异性地干预慢性疼痛，具有潜在临床应用前景[19]。