Mg2+
1.5mmol/L
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• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
PCR仪
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PCR反应
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
• 灵敏度高
1. 皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平
2. 能从100万个细胞中检出一个靶细胞
3. 病毒检测的灵敏度可达3个RFU 4. 细菌检测的最小检出率为3个细菌
• 简便、快速
1. 一次性加好反应液，2～4 小时完成扩增 2. 扩增产物一般用电泳分析
• 对标本的纯度要求低
血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组 织等组织的粗提DNA
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PCR反应体系
1）PCR反应成分
（1）模板 单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制
• 但由于测序和引物合成的困难，以 及70年代基因工程技术的发明使克 隆基因成为可能，所以，Khorana的 设想被人们遗忘了……
2020的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
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• 1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了 聚合酶链反应（PCR）
3’
子链延长
3’ 解旋酶解链酶 5’
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PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
DNA 5’ ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC
解旋解链
GGAUCG
RNA引物
合成引物
RNA引物
5‘ AUCGCG
引物酶
子链延长 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
加拿大、澳大利亚也是转基因食品的生 产大国，均有几千万人在吃，到现在为 止也没有—个案例说明它有问题 。
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反对派的观点
• 一英国科学家声称，转基因马铃薯会减 弱老鼠免疫系统功能；
• 美国康乃尔大学也发现，转基因玉米会 危害蝴蝶幼虫及其相关生态环境。
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• 环保团体认为这种违反自然的转基因作 物及产品，未经长期安全测试，长期食 用可能对人类及生态环境造成负面影响。
第一批列入目录的农业转基因生物是： • 大豆：大豆种子、大豆、大豆粉、大豆油、豆粕 • 玉米：玉米种子、玉米、玉米油、玉米粉 • 油菜：油菜种子、油菜籽、油菜籽油、油菜籽粕 • 棉花种子 • 番茄：番茄种子、鲜番茄、番茄酱
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“转基因食品” （Genetically Modified Foods)
• 我国有一半以上的大豆色拉油含有转基 因成分。
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究竟什么是转基因食品？ 转基因食品是否安全？ 它是否存在长期的隐患？
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一. 转基因食品
主要内容
• 定义 • 发展 • 应用 • 安全性评价
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What is Genetically Modified？ 什么是转基因？
中的应用
一、生物芯片简介
二. 生物芯片在食 品中的应用
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一. 生物芯片简介
美国《科学》杂志将生物芯片评选为 1998 年世界科技十大突破之一。
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生物芯片的发展历程
☆ 各国企业与政府均瞄准这一新兴产业，纷纷 投入巨资建 立研发机构。
☆ 中国政府决定于2000、2001年在北京与上海分别建立生 物芯片国家工程研究中心。
②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单 链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列 配对结2合020；/5/13
PCR Cycle – 第三步
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③引物的延伸： DNA模板--引物结 合物在TaqDNA聚 合酶的作用下，以 dNTP为反应原料， 靶序列为模板，按 碱基配对与半保留 复制原理，合成一 条新的与模板DNA 链。
• 就目前而言，还没有发现转基因食品对人 类有害，但同时也缺乏证据证明它的无害 性，因此产生了一些争论。
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• 从本质上讲，转基因生物和常规育种的品种 是一样的．
• 两者都是在原有的基础上对某些性状进行修 饰，或增加新性状、或消除原有不利性状。
• 有意识的杂交育种已有100多年的历史．
2 cycle = 4 Amplicon
3 cycle = 8 Amplicon
4 cycle = 16 Amplicon
5 cycle = 32 Amplicon
6 cycle = 64 Amplicon
7 cycle = 128 Amplicon
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No. of Cycles
1 2 3 4 5 6 20 30
Kary B. Mullis <<The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction>> 1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项 重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸 年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。
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PCR技术的主要类型
㈠反向PCR ㈡不对称PCR ㈢RT-PCR ㈣差异显示PCR ㈤实时定量PCR
㈥锚定PCR ㈦原位PCR ㈧重组PCR ㈨免疫PCR ㈩多重PCR
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三.PCR在食品中的应用
• 食品微生物检测 • 转基因食品的检测
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第八章 生物芯 片及其在食品
3’
子链延长 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’
5’
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PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
• 1971年，Khorana提出：经过DNA变 性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶 延伸引物，并不断重复该过程便可 克隆tRNA基因。
End of the 1st PCR Cycle – Results in two copies of target sequence
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每完成一 个循环需 2～4分钟， 2～3小时 就能将待 扩目的基 因扩增放 大几百万 倍。
Target Amplification
1 cycle = 2 Amplicon
☆ 近年来美国FDA批准了二款可以用于临床检测的芯片产 品, 开始了生物芯片由研究市场向临床诊断市场的转变。
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1996年至今，共有13,000 多篇微阵列芯片相关论 文发表，其中1,000 多篇发表在Cell、Nature（及姊 妹刊）、Science 等国际顶级学术刊物上。
• 是指用转基因生物制造、生产的食品、 食品原料及食品添加物等。
• 简称：GMF
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为什么会对转基因食品有恐惧心理？
• 据专家分析，转基因食品在基因重组与改 变过程中，可能产生某种毒性、过敏性， 生成抗营养因子。引起营养成分改变，或 者某种抗抗生素基因随食品转移到肠道， 使抗生素对该机体从此失去疗效。
剂、DNA结合蛋白类。 一般100ng DNA模板/100L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。
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（2）引物浓度 0.1-0.5 mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特
异性下降。 （3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
0.5-2.5 U/50 l 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影 响反应产量。
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转基因植物的安全性争论
• 支持派认为：如果转基因农业生物技术 得不到社会支持，这一研究将被扼杀， 并且强调，迄今为止并没有发现转基因 食品危害人体健康和环境的确切证据。
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• 美国人食用转基因食品已多年，超级市 场上有4000多种商品是含有转基因植物 成分的，还没有事例证明人吃了以后会 得病，甚至会引起死亡。
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（4）dNTP(脱氧核苷三磷酸) dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度
过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下
降，影响DNA聚合酶的活性。
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（5） Mg2+
Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。 0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下 降； Mg2+过高影响反应特异性。 Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、 EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。
PCR的基本原理
• 类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA• 模板加热变性解链，随之将反应混合物 冷却至某一温度，这一温度可使引物与 它的靶序列发生退火，再将温度升高使 退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。 这种热变性-复性-延伸的过程就是一个 PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种 循环的不断重复。
第八章 PCR及 其在食品 中的应用
一、转基因食品 二. PCR技术 三.PCR在食品中的应用
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你吃过转基因食品吗？
• 不管您愿不愿意，您己经或正在把 转基因食品吃进肚里
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• 转基因食品已经走进我国百姓的生活。
• 国内尚没有转基因作物的大规模生产
• 近几年我国大量从美国、阿根廷等国进 口大豆，其中大部分是转基因大豆。
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二. PCR技术