体外抗肿瘤活性试验
生长曲线测定法
验原理：在最适条件下，肿瘤细胞在培养液中呈指数生长，如取细胞数 数与培养时间作图可得一条直线，故称此时为对数生长期。随着细胞密 断增高，由于代谢产物的积聚及营养物的消耗，细胞生长逐渐减慢以致 ，此时称高坪期或稳定期。因此药物对细胞生长的影响可通过生长曲线 出来 。 法要点： 将浓度为10000个细胞/ml的对数生长期细胞悬液按每瓶5ml种 ml的培养瓶，或按每孔100微升种至96孔板，并加受试样品适量，培养 别于即刻和1、2、3、4、5、6、7d进行检测。前者可采用台盼蓝染色计 活细胞，后者可采用MTT法或SRB法读取OD值，并据此进行作图与计算 测指标 1、倍增时间(TD),将实际生在曲线进行直线回归求出0和t时刻的 论细胞数N0和N t，据此计算：TD=0.301t/（log N t—log N0）；2 增殖 杀伤率（%）=( N0—N0’)/ N0×100%；3 细胞生长饱和密度（N s）， 高坪期每毫升细胞数的均数。
体内抗肿瘤试验必须选用三种以上肿瘤模型，其中至 3 少一种为人癌裸小鼠移植模型或其它人癌小鼠模型。
试验结果三种模型均为有效，再重复一次也为有效
体外抗肿瘤活性试验 试验目的
对候选化合物进行初步筛选 了解候选化合物的抗瘤谱 为随后进行的体内抗肿瘤试验提供参考
体外抗肿瘤活性试验
试验方法
• 选用10-15株人癌细胞株 • 试验还应考察受试物对耐药肿瘤细胞系和正常人源细胞的作用和影
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体外抗肿瘤活性试验
集落形成法
验原理：克隆原细胞具有持续增殖能力，当单个细胞分裂6代或6代以上 后代所组成的群体(集落)便含50个以上细胞。通过集落计数可对克隆原 作定量分析。它反映了单个细胞的增殖潜力，故能较灵敏地测定抗癌药 性，日前被认为是一种较理想的检测方法。 法要点：将浓度为500个细胞/ml的对数生长期细胞悬液2ml种至35ml的 皿，并加受试样品适量，培养7d或更长时间，姬姆萨染色，解剖显微镜 数含50细胞以上的集落。 测指标：根据集落数计算集落形成率，对照组集落形成率不应低于40% 计算用药组的集落形成抑制率，根据情况可进一步采用Logit法计算受试 的IC50值。 集落形成率=集落数/细胞接种数X100% 集落形成抑制率=（1-用药组集落形成率）/对照组集落形成率X100%
值可随放置时间而变，而SRB法无此现象。因此更适用于进行大规模的 验。 法要点： 用10%冷三氯乙酸与4℃固定已经受试样品处理的细胞1h，洗 燥；加入4mg/ml SRB液100微升/孔 染色15min，1%冰醋酸洗涤，干燥 后加入150微升/孔 的Tris溶液，在酶标仪上与515nm波长处检测OD值。 测指标 同MTT法。另外，NCI目前采用以下指标评价化合物的体外抗肿 活性。测定的OD值包括对照组、加药组及加药时的细胞的OD值C、T、
响 • 使用MTT还原法、磺酰罗丹明B(SRB)染色法 • 药物与细胞共培养时间一般为48-72 小时，贴壁细胞需先贴壁24
小时后再给药。 • 试验应设阴性、阳性、溶媒对照组，阳性对照用一定浓度的标准抗
肿瘤药。 • 试验至少应重复一次
体外抗肿瘤活性试验
四氮唑盐还原法
验原理：四氮唑[MTT,3-(4,5-dimethylibiazol-2-yl)-2,5-diphenylazolium bromide]是一种能接受氢原子的染料。活细胞线粒体中与NAD 关的脱氢酶在细胞内可将黄色的MTT转化成不溶性的蓝紫色的甲[月替] mazan)，而死的细胞则无此功能。用二甲基亚讽(DMSO)溶解甲[月替 一定波长下用酶标仪测定光密度值，即可定量测出细胞的存活率。 法要点：受试样品处理细胞结束后，加入5mg/ml MTT液20微升/孔，继 养四小时。再加三联液并培养过夜。在酶标仪上于490nm波长处检测O 。 测指标 直接指标为96孔板上各被测孔的OD值；然后按公式（对照组O 治疗组OD值）/对照组OD值×100%计算出相应的细胞生长抑制率；剧
可进一步采用Logit法计算50%生长抑制浓度IC50值。
体外抗肿瘤活性试验
磺酰罗丹明染色法
验原理：SRB(sulforhodamine 是一种蛋白质结合染料，粉红色，可溶于 。 SRB可与生物大分子中的碱性氨基酸结合。其在515 nm波长的OD读 细胞数呈良好的线性关系。故可用作细胞数的定量。MTT法的一个缺点
抗肿瘤药物评价技术
肿瘤药物药效学指导原则
细胞毒类抗肿瘤药物非临床研究 技术指导原则
化学药物一般药理学研究技术指导原则
指导原
中药、天然药物一般药理学研究技术指导原则
抗肿瘤药物药效学研究的要求
1 体内、体外实验方法相结合；以体内实验为主
•
• 2 体外实验选用10-15株人癌细胞株 ，至少重复一次
0。据此计算： 生长抑制率（%）=（T－T0）/（C—T0）×100% ； 按生长抑制 细胞死亡率对样品浓度绘出量效关系曲线图，并求出IC50
体外抗肿瘤活性试验
染料排斥法
验原理：活细胞有排斥某些染料如伊红、台盼蓝、苯胺黑等的能力，而 胞由于膜完整性的破坏，可被着色。因此培养的肿瘤细胞中加入这些染 定时间后，对着色和未着色的细胞进行计数，即可算出被杀死的细胞比 法要点：向一定容积的待检细胞悬液加入定量的某种染液，最常用的是 %台盼蓝液，混匀，室温染色5-15min，将已染色的细胞悬液滴加至血 计数板，直接在光镜下计数活细胞数和细胞总数。 测指标：按（未染色细胞数/细胞总数）X100%计算活细胞率，对照组活 胞率应在90%以上。根据活细胞率计算受试样品的半数致死剂量（LD5 为药物抗肿瘤活性的指标。
体外抗肿瘤活性试验
阿拉马蓝法
验原理：非荧光性蓝色底物阿拉马蓝可被活细胞中的线粒体内 NADPH相关的脱氢酶类还原为强荧光性粉红色底物，采用微 养板自动读数仪在激发与发射波长分别为530nm和590nm处读 荧光强度值，与活细胞数呈良好的线性关系。 法要点：细胞经受试样品处理后，加入10-20ul阿拉马蓝染液 续培养一定时间，用微培养板自动读数仪在激发与发射波长分 为530nm和590nm处读取荧光强度值。 测指标：根据荧光强度可以计算细胞生长抑制率，适当时可进 步计算IC50值。